Wnt信號(hào)通路抑制蛋白Chibby在喉癌發(fā)生中的作用.pdf

1、目的：國內(nèi)外大量研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的關(guān)系。Chibby為近年來新發(fā)現(xiàn)的該信號(hào)通路拮抗劑，通過對β-catenin的抑制，拮抗異常Wnt信號(hào)，可能是潛在的腫瘤抑制因子。已有研究表明Chibby與多種腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系，但尚無Chibby與喉癌關(guān)系的研究報(bào)道。本研究旨在從表達(dá)及功能層面系統(tǒng)闡述Chibby與喉癌的關(guān)系，為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路在喉癌發(fā)病中的作用機(jī)

2、制，尋找新的作用靶標(biāo)，為喉癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、分別采用Real-time PCR方法及免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測喉癌組織與相應(yīng)癌旁正常喉粘膜中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)變化。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析腫瘤組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)差異與喉癌患者不同年齡、性別、臨床分期及腫瘤分化程度間的關(guān)系。
　　2、通過GeneBank檢索人類Chibby mRNA編碼序列，

3、應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5設(shè)計(jì)引物獲取目的片段，經(jīng)XbaⅠ/MIuⅠ雙酶切后構(gòu)建重組質(zhì)粒plv-cs2.0-Cby。利用脂質(zhì)體（TurboFect）法進(jìn)行慢病毒包裝獲取病毒上清。采用相同滴度的病毒上清感染喉癌細(xì)胞系Hep-2，經(jīng)Puro篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Chibby的Hep-2細(xì)胞系，分別采用Real time PCR方法及Western blot方法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中Chibby的過表達(dá)效率。
　　3、分別采用M

4、TT法檢測細(xì)胞增殖能力；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布；Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1、與正常喉粘膜相比較，喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白表達(dá)的降低率分別為56.67％（17/30）及80.00%（24/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)差異與患者的性別、年齡、臨床分期及腫瘤分化程度間無明顯關(guān)系（p＞0.05）

5、。
　　2、目的基因PCR擴(kuò)增得到421bp大小的目的片段，重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ/MIuⅠ雙酶切后得到8750bp及414bp大小的基因片段，經(jīng)XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切后得到6886bp、1384bp及894bp大小的基因片段，均與理論大小相符，序列測定與Genebank公布一致。經(jīng)Real time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)Chibby mRNA過表達(dá)了276.92倍（p＜0.01），經(jīng)Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)了外源C

6、hibby蛋白，未見內(nèi)源Chibby蛋白條帶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。
　　3、與control組及plv-cs2.0組細(xì)胞相比較，plv-cs2.0-Cby組細(xì)胞增值能力減弱，且隨著時(shí)間延長，減弱越明顯（P＜0.05）。plv-cs2.0-Cby組細(xì)胞的克隆形成數(shù)及克隆面積明顯低于contro l組與p lv-cs2.0組（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，plv-cs2.0-Cby組細(xì)胞滯留在G1期；而S細(xì)胞明顯減

7、少（P＜0.05）。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，相對于control組及plv-cs2.0組，plv-cs2.0-Cby組的凋亡比例明顯增加（P＜0.01）。而control組與plv-cs2.0組細(xì)胞間的增值能力、克隆形成能力、細(xì)胞周期分布及凋亡比例無差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、與正常喉粘膜相比較，喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)水平均降低，未發(fā)現(xiàn)喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達(dá)差異與患者的

8、性別、年齡、臨床分期及腫瘤分化程度間存在相關(guān)關(guān)系。
　　2、酶切鑒定及序列測定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了plv-cs2.0-Cby慢病毒真核過表達(dá)載體，經(jīng)慢病毒包裝及感染喉癌細(xì)胞系Hep-2后，在Hep-2中有效的過表達(dá)了外源Chibby，為功能實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　3、過表達(dá)Chibby后，有效的抑制了喉癌細(xì)胞系Hep-2的增值能力及克隆形成能力，將Hep-2細(xì)胞滯留在G1期，促使了Hep-2細(xì)胞的凋亡。因此，過表達(dá)Chibby