秸稈還田土壤中高效纖維素分解菌的篩選、鑒定及其生物效應(yīng)研究.pdf

1、中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),年產(chǎn)各種農(nóng)作物秸稈約8.0億t,占世界秸稈總產(chǎn)量的20％～30%,其中絕大部分作為廢棄物被丟棄焚燒,不僅浪費(fèi)了資源,也造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題。秸稈還田是當(dāng)今世界上普遍關(guān)注的一項(xiàng)培肥地力和增產(chǎn)增效的農(nóng)藝措施,但還田玉米秸稈存在腐解難的問題,如何加速還田玉米秸稈的腐解是目前研究的熱點(diǎn)。本研究采用纖維素-剛果紅染色法從河北省山前平原小麥-玉米輪作區(qū)且長(zhǎng)期秸稈還田的小麥季農(nóng)田土壤中分離篩選出高效分解纖維素的菌株,在優(yōu)化其產(chǎn)酶條件、

2、發(fā)酵條件和CMC酶活力的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了該菌株對(duì)玉米秸稈的腐解能力、土壤中固定態(tài)磷的釋放和小麥生長(zhǎng)及其磷營(yíng)養(yǎng)狀況的影響等方面研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.采用纖維素-剛果紅染色法,經(jīng)形態(tài)鑒定初步篩選出具有纖維素分解菌真菌8株,細(xì)菌20株;進(jìn)一步采用水解圈測(cè)定,酶活力比較分析,得到高效纖維素分解真菌1株,編號(hào)為HB1,經(jīng)18SrDNA基因序列分析,確定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum),命名為草酸青霉HB1(

3、P.oxalicumHB1),該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏號(hào)為CGMCCNO.4842;得到高效纖維素分解細(xì)菌3株,編號(hào)為B1,B2和B3,其中B1、B2為芽孢桿菌,B3為無芽孢桿菌;室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)研究了草酸青霉HB1和3株細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線,并對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶(CMC酶)和濾紙酶(FPA酶)活力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,利用CMC-Na培養(yǎng)基,按1%接種量,30℃,180rpm搖瓶培養(yǎng)72h,草酸青

4、霉HB1菌株的CMC酶和FPA酶活力分別達(dá)672.8U和774.6U。培養(yǎng)12h時(shí),B1和B3菌CMC酶活力近峰值,分別為31.2U和24.4U;培養(yǎng)18h時(shí),B2菌CMC酶活力達(dá)最高,為36.3U。培養(yǎng)12h時(shí),B1菌FPA酶活力達(dá)高峰,為34.1U;培養(yǎng)8h時(shí),B2、B3菌FPA酶活力最大,分別為39.2U和163.6U。綜合比較發(fā)現(xiàn)草酸青霉HB1菌株的CMC酶和FPA酶活力最高,因此對(duì)該菌株展開如下系統(tǒng)的研究。
　　 2.

5、草酸青霉HB1菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　 首先選擇氮源、接種量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH進(jìn)行單因子試驗(yàn),對(duì)草酸青霉產(chǎn)酶條件的影響,結(jié)果表明該菌最佳產(chǎn)酶條件為3%的牛肉膏蛋白胨為氮源,接種量為5%,培養(yǎng)溫度為28℃～35℃,pH=4.0～7.0,培養(yǎng)48h～72h。進(jìn)一步采用正交設(shè)計(jì)研究了pH、溫度、固液比和培養(yǎng)時(shí)間四因素對(duì)草酸青霉HB1菌株發(fā)酵的影響,綜合考慮CMC酶、FPA酶、纖維素酶、半纖維素酶四種酶活力,該菌株最優(yōu)

6、發(fā)酵條件為固液比為1:10,培養(yǎng)時(shí)間為48h,培養(yǎng)溫度為30℃,pH為6.5。
　　 在草酸青霉HB1菌株作為纖維素分解菌,以CMC-Na液體培養(yǎng)作基質(zhì),研究CMC酶活力的結(jié)果表明,該酶反應(yīng)的最適pH為5.0左右,其pH的穩(wěn)定性在4.0～5.0范圍內(nèi),酶反應(yīng)的最適溫度為50℃,其熱穩(wěn)定性在40℃～50℃之間。
　　 3.草酸青霉HB1對(duì)玉米秸稈腐解能力評(píng)價(jià)
　　 采用室內(nèi)搖瓶試驗(yàn)、土樣培養(yǎng)試驗(yàn)及小麥盆栽試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)

7、行了系統(tǒng)研究。利用玉米秸稈替代CMC-Na的培養(yǎng)基中,按1%接種量,30℃,180rpm搖瓶培養(yǎng)72h,CMC酶和FPA酶活力則分別為282.9U,618.3U,纖維素酶活力為376.1U;利用3%的牛肉膏蛋白胨為氮源,接種量為5%,培養(yǎng)溫度為30℃,pH=7.0,培養(yǎng)72h,其CMC酶活力高達(dá)888.8U。從腐解秸稈的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn),草酸青霉HB1處理的秸稈與對(duì)照相比形態(tài)發(fā)生明顯改變,在培養(yǎng)10d后,秸稈腐解率達(dá)87.3%,為對(duì)照的1.

8、90倍;初步說明該菌株具有較強(qiáng)的玉米秸稈腐解能力。在土壤培養(yǎng)試驗(yàn)中,培養(yǎng)30d時(shí),接種草酸青霉HB1的土壤中玉米秸稈的腐解率達(dá)83.5%,是對(duì)照的1.62倍;在小麥盆栽試驗(yàn)中,培養(yǎng)50d時(shí),接種草酸青霉HB1的土壤中還田秸稈腐解率達(dá)70.8%,高于對(duì)照15.1%。4.土壤中接種草酸青霉HB1的解磷作用及其生物效應(yīng)研究
　　 土壤培養(yǎng)試驗(yàn)以及小麥盆栽試驗(yàn)研究還表明,接種草酸青霉HB1有利于土壤固定態(tài)磷的釋放和提高植物對(duì)磷的吸收利用

9、。在土壤培養(yǎng)30d時(shí),處理組和對(duì)照組中土壤速效磷含量分別達(dá)98.6mg/kg和77.1mg/kg,高出對(duì)照27.9%;在培養(yǎng)50d時(shí),小麥植株地上部和地下部,處理組和對(duì)照組全磷含量分別為12.6g/kg、7.62g/kg和25.9g/kg、21.1g/kg,分別高出對(duì)照65.3%和22.7%,差異顯著性分析表明,各處理組與其對(duì)照組差異顯著;同時(shí)有利于植物的生長(zhǎng),在培養(yǎng)30d時(shí),小麥植株生物量增加16.8%。
　　 本試驗(yàn)所獲得的