中醫(yī)骨折分期治療對(duì)骨折愈合bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1、研究背景
　　 骨折分期的辨證施治方法是中醫(yī)治療骨折的一大特色，是前人經(jīng)過(guò)不斷總結(jié)發(fā)展而來(lái)的。中醫(yī)骨傷學(xué)家總結(jié)了骨折三期辨證治療，骨折三期治療原則是中醫(yī)藥治療骨折的指導(dǎo)原則。中醫(yī)骨折三期治則臨床療效已證實(shí)，但實(shí)驗(yàn)證據(jù)不完善。雖然臨床療效已得到充分的驗(yàn)證，但對(duì)其研究往往局限于臨床療效觀察。目前對(duì)中醫(yī)骨折三期治則的作用存在諸多爭(zhēng)議，無(wú)論在是否分期還是在分期的方法上都有明顯的分歧，出現(xiàn)了不分期的治療，以及分期的三期治療和二期治療的

2、不同情況，使得骨折三期治療做為中醫(yī)藥治療骨折的指導(dǎo)原則的地位受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致了中醫(yī)藥在治療骨折的發(fā)展受到嚴(yán)重的制約。但是既往研究較多為臨床療效的初步觀察，而且均是中藥湯劑組與空白對(duì)照組、單味中藥與空白對(duì)照組或某種中成藥與空白對(duì)照組之間的相互做比較，所以認(rèn)為不分期的一期治療或二期治療能夠促進(jìn)骨折愈合，但并均不能充分說(shuō)明一期治療與二期治療療效強(qiáng)于三期治療。而關(guān)于中醫(yī)骨折三期治療原則的作用及其機(jī)制系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　

3、　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在SD大鼠骨痂愈合過(guò)程中，二期治療不但可以明顯提高其骨折愈合過(guò)程中bFGF（Basic fibroblast growth factor堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）的表達(dá)量，二期治療對(duì)骨折愈合過(guò)程中bFGF表達(dá)的促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于三期治療和一期治療。并在前期的家兔骨折愈合過(guò)程的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)在骨折愈合時(shí)間及質(zhì)量上分期的治療組明顯強(qiáng)于不分期治療組，骨折三期治療組無(wú)論在外骨膜、骨干細(xì)胞、骨小梁組織、骨痂質(zhì)量及骨髓組織等

4、骨折端組織的VEGF（Vascular endothelial growth factor血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）和VEGFmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于一期治療組。
　　 bFGF有促血管形成、誘導(dǎo)胚胎發(fā)育、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)等功能。另外TGF-β（Transforming growth factor-β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β），可促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、刺激Ⅱ型膠原、骨連接素和骨橋蛋白的合成，TGF-β在骨組織代謝過(guò)程中

5、起重要的作用。而VEGF是目前公認(rèn)最強(qiáng)的促血管形成因子，不僅能夠促進(jìn)血管重建，而且還能夠增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活性，其他促血管生成因子對(duì)于血管重建時(shí)全部或部分通過(guò)VEGF的作用得以實(shí)現(xiàn)。bFGF與VEGF兩因子都是對(duì)血管重建較為重要的因子，而骨的愈合過(guò)程中，骨形成的最關(guān)鍵因子的莫過(guò)于BMPs（Bone morphogenetic proteins骨形成蛋白），其具有誘導(dǎo)成骨作用，尤其是間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨向、聚集、分化形成軟骨和骨，最終形成骨髓，

6、因此，被認(rèn)為是最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)分化因子，而實(shí)驗(yàn)研究方面對(duì)于在骨折愈合過(guò)程中較為重要的BMPS多進(jìn)行其家族的BMP-2研究。我們?yōu)檩^傘面的從分子生物水平更進(jìn)一步探討中醫(yī)骨折分期治療的作用及其機(jī)制，研究骨折治療的合理分期方法，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)中醫(yī)分期治療將從bFGF、TGF-β、VEGF及BMP-2四個(gè)生長(zhǎng)因子同時(shí)進(jìn)行全方位的分析。
　　 2、研究目的
　　 本研究擬通過(guò)對(duì)家兔雙側(cè)橈骨中下1/3旋前圓肌遠(yuǎn)端3mm橫斷骨折的bFGF

7、、TGF-β、VEGF、BMP-2及其bFGFmRNA、TGF-βmRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的基因表達(dá)、細(xì)胞因子的表達(dá)及其分布規(guī)律的影響情況，從分子水平層次對(duì)家兔橈骨下段骨缺損的愈合進(jìn)行分期，進(jìn)而從器官、細(xì)胞與分子水平系統(tǒng)地闡明中醫(yī)骨折分期治療對(duì)骨折愈合的作用及其機(jī)制，確定最佳的分期治療方案，闡明中醫(yī)骨折分期治療的原則，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度為中醫(yī)藥分期治療骨折提供更為科學(xué)的理論根據(jù)，指導(dǎo)骨折的治療。
　　 3、材

8、料與方法
　　 3.1研究對(duì)象及建立骨折模型
　　 本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為實(shí)驗(yàn)用雄性新西蘭家兔174只，于雙側(cè)橈骨中下1/3處在旋前圓肌肌止遠(yuǎn)端用鋸造成3mm橫斷骨折，不作任何固定。用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字的方法將174只家兔先隨機(jī)取出6只作為對(duì)照組，其余168只家兔隨機(jī)分為四組，每組42只。分別為中藥三期治療組、中藥二期治療組、中藥一期治療組、模型對(duì)照組。每個(gè)小組再隨機(jī)分為7個(gè)小組，每組6只。分別為3、6、9、14、28、42、

9、56天組。
　　 3.2干預(yù)方法
　　 3.2.1給藥方法:將家兔橈骨骨折愈合過(guò)程分為三期:早期，即血腫機(jī)化演進(jìn)期，骨折后1-7天;中期，即原始骨痂形成期，骨折后8-28天;后期，即改建塑形期，骨折后28天以后。
　　 本研究所選用的肢傷一方、二方及三方選自高等中醫(yī)藥院校統(tǒng)編教材《中醫(yī)正骨學(xué)》。
　　 1組:中藥三期治療組將骨折愈合過(guò)程分為三期，早期，活血化瘀、行氣止痛，給予肢傷一方，中期，接骨續(xù)筋、舒筋

10、活絡(luò)，給予肢傷二方:末期，補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨，給予肢傷三方。
　　 2組:中藥二期治療組將骨折愈合過(guò)程分為兩期，早期，給予肢傷一方加減方;將中醫(yī)骨折三期治療的中期和末期合并為后期，給予肢傷二方與三方的綜合方（后期方）。
　　 3組:中藥一期治療組將骨折愈合過(guò)程不分期，給予肢傷一方、二方與三方的綜合方（一期方）。
　　 4組:模型對(duì)照組給予等量蒸餾水，灌胃，每日2次。
　　 5組:空白對(duì)照組給予等量蒸餾水，

11、灌胃，每日2次。
　　 3.3標(biāo)本處理
　　 術(shù)后第3、6、9、14、28、42、56天每組隨機(jī)抽取一小組家兔用空氣栓塞法處死，取左側(cè)橈骨標(biāo)本為觀察對(duì)象，經(jīng)固定，脫鈣及HE染色切片制作等程序，采用免疫組化及原位雜交的方法觀察骨折不同時(shí)間點(diǎn)bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2及其bFGFmRNA、TGF-βmRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的表達(dá)情況，在骨折中心以及兩斷端附近相同位置取9個(gè)高倍鏡視野，采用

12、美國(guó)3Y彩色圖像分析系統(tǒng)與Pixelpro Ver4.0圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行光密度測(cè)定。
　　 3.4統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用一般線性模型的重復(fù)測(cè)量過(guò)程對(duì)骨折愈合過(guò)程中每種組織MOD值組間差異進(jìn)行比較，并應(yīng)用LSD法對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間差異進(jìn)行比較，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s），表示檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 4結(jié)果
　　 4.1 bFGF及b

13、FGFmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 4.1.1外骨膜bFGF表達(dá)結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01。術(shù)后第9天，三組治療組均達(dá)到高峰，但明顯分期組明顯最高，二期組高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于一期組，三

14、期組高于模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。總體而言，分期組均保持較高的水平，且明顯強(qiáng)于模型對(duì)照組以及不分期的一期組。
　　 4.1.2外骨膜bFGFmRNA表達(dá)結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，

15、有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第9天，二期組達(dá)到高峰，二期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組無(wú)論高峰期還是峰值水平均強(qiáng)于不分期的一期組和模型對(duì)照組。
　　 4.1.3內(nèi)骨膜bFGF表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，

16、差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第9天，二期組高于一期組、模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期治療組峰值水平仍高于不分期組及模型對(duì)照組。
　　 4.1.4內(nèi)骨膜bFGFmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組和三期組，差異非常顯著，P＜0.0

17、1;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第9天，二期組高于一期組、模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;也高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05?？傮w而言，分期組峰值水平以及高峰期均強(qiáng)于一期組及模型對(duì)照組。
　　 4.1.5骨髓腔bFGF表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0

18、.01;二期組高于三期組，一期組高于模型對(duì)照組，三期組高于一期組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第14天，二期組高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.1.6骨髓腔bFGFmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0

19、.01;二期組高于三期組，一期組高于模型對(duì)照組，三期組高于一期組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第14天，三期組高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組大部分時(shí)間點(diǎn)的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.2 TGF-β及TGF-B mRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 4.2.1外骨膜TGF-β表達(dá)結(jié)果
　　 均值組間兩兩比較，二期組、三

20、期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，一期組高于模型對(duì)照組，三期組高于一期組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組高于一期組、三期組、模型對(duì)照組，三期組高于一期組，均差異非常顯著，P＜0.01。總體而言，分期組均保持較高的水平，且明顯強(qiáng)于模型對(duì)照組以及不分期的一期組。
　　 4.2.2外骨膜TGF-βmRNA表達(dá)結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期

21、組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組高于一期組、模型對(duì)照組，均差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于一期組，均有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組無(wú)論高峰期還是峰值水平均強(qiáng)于不分期的一期組和模型對(duì)照組。
　　 4.2.3內(nèi)骨膜TGF-β表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組

22、、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于一期組，一期組高于模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組高于一期組、三期組、模型對(duì)照組，均差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組、模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期治療組峰值水平仍高于不分期組及模型對(duì)照組。
　　 4.2.4內(nèi)骨膜TGF-βmRNA表達(dá)的結(jié)果

23、　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于一期組，一期組高于模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組高于一期組、模型對(duì)照組，三期組高于一期組，均差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于一期組、模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05?？傮w而言，分期組峰值水平以及高峰期均強(qiáng)于一期組及模型對(duì)照組。

24、r>　　 4.2.5骨干細(xì)胞TGF-β表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于一期組，一期組高于模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組高于一期組、模型對(duì)照組，均差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組的峰值水平及高

25、峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.2.6骨干細(xì)胞TGF-βmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，三期組高于一期組，一期組高于模型對(duì)照組，均有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組高于模型對(duì)照組、一期組;三期組高于模型對(duì)照組，均差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于三期組，一期組高于模型對(duì)照組，均

26、有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組大部分時(shí)間點(diǎn)的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.3 VEGF及VEGFmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 4.3.1外骨膜VEGF表達(dá)結(jié)果
　　 組間兩兩比較，三組中藥治療組MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01。其中二期組的平均MOD值最高，二期組高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05，一期組高于模型對(duì)照組，差異

27、非常顯著，P＜0.01。術(shù)后第6天，二期組最高，與一期組及模型對(duì)照組相比，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組和模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05?？傮w而言，分期組均保持較高的水平，且明顯強(qiáng)于模型對(duì)照組以及不分期的一期組。
　　 4.3.2外骨膜VEGFmRNA表達(dá)結(jié)果
　　 組間兩兩比較，二期、三期治療組MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01，一期治療組MOD值顯著高于模型對(duì)照組，P＜0.05。其中二期組

28、的平均MOD值最高，二期組高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05，一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第6天，二期組高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組無(wú)論高峰期還是峰值水平均強(qiáng)于不分期的一期組和模型對(duì)照組。
　　 4.3.3內(nèi)骨膜VEGF表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，一期組、二

29、期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第6天，二期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;二期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01。從總體而言，分期治療組峰值水平仍高于不分期組及模型對(duì)照組。
　　 4.3.4內(nèi)骨膜VEGFmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD

30、值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組強(qiáng)于模型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第6天和術(shù)后第9天，二期組均高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組均高于一期組，有顯著差異，P＜0.05;三期組均高于模型對(duì)照組，有顯著差異，P＜0.05?？傮w而言，分期組峰值水平以及高峰

31、期均強(qiáng)于一期組及模型對(duì)照組。
　　 4.3.5骨髓腔VEGF表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，一期組、二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第9天，二期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;二期組均高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組

32、均高于一期組，有顯著差異，P＜0.05。從總體而言，分期組的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.3.6骨髓腔VEGFmRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組強(qiáng)于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.0

33、5。術(shù)后第9天，二期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;二期組均高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組均高于一期組，有顯著差異，P＜0.05。從總體而言，分期組大部分時(shí)間點(diǎn)的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.4 BMP-2及BMP-2mRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 4.4.1外骨膜BMP-2表達(dá)結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，一期組、二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.

34、01;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組、三期組均高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;一期組強(qiáng)于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05?？傮w而言，分期組均保持較高的水平，且明顯強(qiáng)于模型對(duì)照組以及不分期的一期組。
　　 4.4.2外骨膜BMP-2mRNA表達(dá)結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較

35、，一期組、二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01。術(shù)后第42天，二期組、三期組均高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;一期組強(qiáng)于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組無(wú)論高峰期還是峰值水平均強(qiáng)于不分期的一期組和模型對(duì)照組。
　　 4.4.3骨干

36、細(xì)胞BMP-2表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，一期組、二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第28天，二期組強(qiáng)于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組、三期組均高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05;二期組高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05。從總

37、體而言，分期治療組峰值水平仍高于不分期組及模型對(duì)照組。
　　 4.4.4骨干細(xì)胞BMP-2mRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第14天，二期組高于模型對(duì)照組、

38、一期組和三期組，差異非常顯著，P＜0.01?？傮w而言，分期組峰值水平以及高峰期均強(qiáng)于一期組及模型對(duì)照組。
　　 4.4.5骨髓腔BMP-2表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.0

39、5。術(shù)后第42天，二期組高于模型對(duì)照組，差異非常顯著，P＜0.01;二期組高于一期組，三期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 4.4.6骨髓腔BMP-2mRNA表達(dá)的結(jié)果
　　 平均值組間兩兩比較，二期組、三期組的MOD值顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組，P＜0.01;一期組高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05;其中二期組最高，高于三期組，有顯著性差異，

40、P＜0.05，也高于一期組，差異非常顯著，P＜0.01;三期組高于一期組，有顯著性差異，P＜0.05。術(shù)后第42天，二期組、三期組均高于模型對(duì)照組，有顯著性差異，P＜0.05。從總體而言，分期組大部分時(shí)間點(diǎn)的峰值水平及高峰期均強(qiáng)于不分期的一期組。
　　 5、結(jié)論
　　 1)家兔骨折愈合過(guò)程中，各部位各時(shí)間點(diǎn)的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2表達(dá)的無(wú)論從免疫組化還是原位雜交檢查中，中藥都能夠促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中不同

41、組織的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2的表達(dá)，可能是中藥促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制之一。
　　 2)骨折三期治療在不同組織表達(dá)都有促進(jìn)bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2及bFGFmRNA、TGF-βmRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的表達(dá)作用，這是骨折三期治療促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制之一，更顯示出骨折分期治療的必要性。
　　 3)骨折愈合過(guò)程中的二期組能夠更好的發(fā)揮作用，使bFGF、TGF-β、VEG

42、F、BMP-2及bFGFmRNA、TGF-β mRNA、VEGFmRNA、BMP-2mRNA的表達(dá)無(wú)論峰值水平，還是峰值時(shí)間都得到充分的提高，因此，二期治療是骨折分期的治療的最合理的分期。
　　 6、創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1)多因子的全面分析骨折愈合過(guò)程
　　 分析了骨折愈合過(guò)程中的促進(jìn)作用的研究往往為單個(gè)因子或者雙因子的表達(dá)，對(duì)各組織當(dāng)中的bFGF、TGF-β、VEGF、BMP-2表達(dá)定量全面分析研究未見(jiàn)報(bào)道。