NCX-2D2抗體對(duì)哇巴因誘發(fā)正常及心力衰竭大鼠心律失常的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　建立哇巴因誘發(fā)正常和心力衰竭大鼠心律失常模型，觀察抗鈉-鈣交換體NCX-2D2抗體對(duì)模型大鼠心律失常的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.哇巴因誘發(fā)成年大鼠離體和在體心臟心律失常模型的建立
　?。?）哇巴因誘發(fā)大鼠離體心律失常模型
　　健康SD大鼠，50 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,開(kāi)胸游離心臟并且懸掛于Langendorff裝置上，進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌流，流速為8 mL

2、·min-1，觀察至少30 min待心電圖波形穩(wěn)定后使用給藥泵給藥，記錄心電圖。
　　實(shí)驗(yàn)分組如下：
　?、僬?duì)照組：含2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺(tái)氏液灌流；
　?、?D2+CaCl2組：含10μg·ml-1 NCX-2D2抗體和2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺(tái)氏液灌流；
　　③ Oua+CaCl2組：含5μmol·L-1 Ouabain和2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺(tái)氏液灌流；<

3、br>　?、?D2+Oua+CaCl2組：含10μg·ml-1 NCX-2D2抗體、5μmol·L-1 Ouabain和2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺(tái)氏液灌流。
　　心電圖記錄藥物干預(yù)后30 min內(nèi)室性期前收縮個(gè)數(shù)，室速和室顫發(fā)生率及持續(xù)時(shí)間。
　?。?）哇巴因誘發(fā)麻醉大鼠心律失常模型
　　健康SD大鼠用30 mg·kg-1水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠置于鼠板上,連接固定肢體導(dǎo)聯(lián)。采用 BL-420F生物機(jī)

4、能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖,連續(xù)觀察30 min心電圖無(wú)異常后尾靜脈給藥,記錄藥物干預(yù)后1 h內(nèi)室性期前收縮的個(gè)數(shù)、室速和室顫持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率。
　　2.大鼠心力衰竭模型的制備
　　取成年健康SD大鼠，隨機(jī)分為偽手術(shù)組和心衰組，術(shù)前禁飲禁食24 h，稱量大鼠體重，給予水合氯醛（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后固定于鼠板上，脫去大鼠腹部的毛，于大鼠左脊肋角后縱向切口2 cm，鈍性分離暴露腹主動(dòng)脈，以7號(hào)針針

5、頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，然后抽出針頭形成腹主動(dòng)脈狹窄，關(guān)閉腹腔。偽手術(shù)組僅不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，其余操作均與心衰組相同。術(shù)后3天每天腹腔注射青霉素20萬(wàn)單位預(yù)防感染。
　　3.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)及HE染色
　　于造模后12周進(jìn)行檢測(cè)。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)以下指標(biāo)：左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。HE染色觀察偽手術(shù)組和心衰組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。心功能檢測(cè)完

6、畢的大鼠，開(kāi)胸取心臟，置于提前預(yù)冷的4℃生理鹽水中，經(jīng)主動(dòng)脈灌流沖洗干凈殘存血液后，分離心房心室，浸泡于4％多聚甲醛固定液中，固定24小時(shí)后常規(guī)脫水，石蠟包埋，心室肌組織切片，厚度為5μm，經(jīng)HE染色，然后鏡下觀察。
　　4.哇巴因誘發(fā)心力衰竭大鼠并發(fā)心律失常模型及心功能測(cè)定
　　取心力衰竭SD大鼠用水合氯醛（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，連接肢體導(dǎo)聯(lián)，記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖；同時(shí)通過(guò)右頸總動(dòng)脈插管

7、至左心室腔測(cè)定心功能，并經(jīng)由頸總動(dòng)脈心室插管給藥的方式給予哇巴因（0.4 mg·kg-1）制備心力衰竭大鼠并發(fā)急性心律失常模型，NCX-2D2抗體（40、60μg·kg-1）、胺碘酮（Amiodarone，3 mg·kg-1）分別于哇巴因注射前5分鐘經(jīng)頸總動(dòng)脈插管給予，觀察給藥后1h期前收縮次數(shù)、室速和室顫發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間的變化；并同步記錄心率、左室最大收縮速率、左室最大舒張速率、左室舒張壓。
　　5.大鼠心室肌細(xì)胞急性分離

8、>　　取健康SD大鼠，50 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，頸動(dòng)脈放血后，快速開(kāi)胸取心臟，修剪后經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管懸掛于 Langendorff灌流裝置上，以無(wú)鈣且100%氧氣的臺(tái)氏液灌流心臟8～10分鐘，灌注環(huán)境：恒壓（75 cmH2O）、恒溫（37℃），后改為膠原酶液（0.07-0.1 g·L-1）循環(huán)灌流15～20分鐘，觀測(cè)心臟肌組織變大、變軟，冠脈血管邊緣不清時(shí)迅速剪下左心室，用KB液快速?zèng)_洗后置于其中，眼科剪剪至2~3m

9、m3小塊，用玻璃吸管（尖端圓潤(rùn)，以免損傷肌細(xì)胞）輕輕吹打3~5 min后即可。過(guò)濾，棄去殘留心臟組織，濾液置于KB液中保存，后將其置于常溫穩(wěn)定3小時(shí)后使用。
　　6.全細(xì)胞膜片鉗記錄
　　應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄大鼠左心室肌細(xì)胞 L-型鈣電流（ICa-L），Na+/Ca2+交換電流（INa/Ca）；在電流鉗模式下記錄大鼠左心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位（AP），施加條件刺激（15 ms3Hz）誘發(fā)延遲后除極。
　　

10、結(jié)果：
　　1. NCX-2D2抗體對(duì)哇巴因誘發(fā)大鼠心律失常具有顯著抑制作用
　?。?）10μg·ml-1 NCX-2D2抗體可明顯抑制哇巴因誘發(fā)大鼠離體心臟心律失常的發(fā)生，在哇巴因組，在給藥30 min內(nèi)100%大鼠發(fā)生室速，71.43%大鼠出現(xiàn)室顫，在給予10μg·ml-1 NCX-2D2抗體干預(yù)后，在觀察期（30 min）內(nèi)大鼠室速和室顫發(fā)生率分別降低至28.5%和0，室速持續(xù)時(shí)間由（192.71±18.45）s縮短至

11、（11.85±20.27） s（P<0.05），室性期前收縮個(gè)數(shù)由303±26減少至78±7（P<0.05）。
　?。?）NCX-2D2抗體可明顯抑制哇巴因誘發(fā)麻醉大鼠心律失常的發(fā)生。在哇巴因組，在給藥后1小時(shí)內(nèi)100%大鼠發(fā)生室速，62.5%大鼠出現(xiàn)室顫。在預(yù)先5分鐘給予60、80μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預(yù)后，在觀察期（1 h）內(nèi)大鼠室速發(fā)生率分別降低為50%、37.5%，室速持續(xù)時(shí)間由（50.91±3.58）min

12、分別縮短至（4.29±4.78）、（0.14±0.21） min(P<0.05），大鼠室顫發(fā)生率分別降低為33.3%、0，60μg·kg-1 NCX-2D2抗體使室顫持續(xù)時(shí)間由（2.83±3.03）min縮短至（0.37±0.58）min（P<0.05）。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，80μg·kg-1 NCX-2D2抗體對(duì)哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照組胺碘酮效果相似。
　　2.腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后12周，大鼠心力衰竭模型制備成功
　　

13、由M型超聲心動(dòng)圖及HE染色發(fā)現(xiàn)，大鼠腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后12周，大鼠出現(xiàn)心力衰竭。M型超聲心動(dòng)圖顯示，大鼠左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑均明顯增大，左室收縮末期內(nèi)徑由（2.05±0.08）mm增大至（5.42±0.29）mm（P<0.05），左室舒張末期內(nèi)徑由（5.25±0.19）mm增大至（7.59±0.36）mm（P<0.05）；左室射血分?jǐn)?shù)由（92±1.37）%減小至（62±5.65）%（P<0.05），左室短軸縮短率由（58±2

14、.48）%減小至（30±2.85）%（P<0.05）。HE染色顯示，心力衰竭大鼠細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大，部分心肌組織出現(xiàn)纖維化。
　　3. NCX-2D2抗體對(duì)哇巴因誘發(fā)心力衰竭大鼠并發(fā)的心律失常具有顯著抑制作用
　　研究結(jié)果顯示，0.4 mg·kg-1哇巴因可明顯增強(qiáng)心力衰竭大鼠心功能，但同時(shí)誘發(fā)出嚴(yán)重的心律失常。預(yù)先給予40、60μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預(yù)后，哇巴因誘發(fā)心衰大鼠并發(fā)的心律失常被明顯抑制

15、，且大鼠心功能較心衰組明顯提高。在哇巴因組100%大鼠發(fā)生室速，66.7%大鼠發(fā)生室顫，在給予哇巴因前5 min給予40、60μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預(yù)后，在觀察期（1 h）內(nèi)室速發(fā)生率分別降低至66.7%和33.3%，在給予哇巴因前5 min給予40、60μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預(yù)后，室速發(fā)生率分別降低至66.7%和33.3%，室速持續(xù)時(shí)間由（1120.8±173.9）s分別縮短至（264.6±206.4）、（

16、8.6±13.5）s（P<0.05），室顫發(fā)生率分別降低至33.3%和16.7%，室顫持續(xù)時(shí)間由（22.50±24.31）s分別縮短至（3.70±6.10）、（1.50±3.67）s（P<0.05），室性期前收縮個(gè)數(shù)由1640±157分別降低至488±19和138±33（P<0.05）。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，60μg·kg-1 NCX-2D2抗體對(duì)室性期前收縮的抑制作用較陽(yáng)性對(duì)照組胺碘酮明顯，對(duì)其他類型心律失常的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照組胺碘酮相似，且

17、其心功能較心衰組大鼠明顯提高。
　　4. NCX-2D2抗體可部分逆轉(zhuǎn)哇巴因?qū)Υ笫髥蝹€(gè)心室肌細(xì)胞鈉-鈣交換電流（INa/Ca）的增大作用
　　在鉗制電位+50mV和-100mV時(shí)，哇巴因組心肌細(xì)胞INa/Ca分別為9.20±0.09和-11.42±0.27(pA/pF），與對(duì)照組4.25±0.05和-4.08±0.09(pA/pF）相比明顯增大（P<0.05）。在哇巴因存在的情況下聯(lián)合給予5μg·ml-1 NCX-2D2抗體

18、后，INa/Ca在+50mV和-100mV時(shí)的外向和內(nèi)向電流分別降低至6.67±0.27和-7.42±0.26（pA/pF），均明顯低于哇巴因組（P<0.05），但仍未完全恢復(fù)至正常水平（P<0.05）。
　　5. NCX-2D2抗體可部分逆轉(zhuǎn)哇巴因?qū)Υ笫髥蝹€(gè)心室肌細(xì)胞L-型鈣電流（ICa-L）的增大作用
　　研究結(jié)果顯示，哇巴因組心肌細(xì)胞 ICa-L為-8.73±0.36(pA/pF），與對(duì)照組-6.30±0.53（pA/

19、pF）相比明顯增大（P<0.05）。在聯(lián)合應(yīng)用5μg·ml-1 NCX-2D2抗體后，ICa-L降至-7.45±0.29（pA/pF），與哇巴因組相比明顯降低（P<0.05），但仍未完全恢復(fù)至正常水平（P<0.05）。
　　6. NCX-2D2抗體可顯著抑制哇巴因誘發(fā)的大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞延遲后除極
　　研究結(jié)果顯示，對(duì)照組和2D2抗體組均未出現(xiàn)延遲后除極（DADs）。哇巴因組大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞DADs發(fā)生率為83.33%，在