心力衰竭心肌微環(huán)境對(duì)成肌細(xì)胞分化及移植后心律失常的影響.pdf

1、目的：
　　 心肌梗死（Myocardial infarction，MI）后行成肌細(xì)胞(skeletal myoblasts，SKMs)心肌內(nèi)移植可有效改善心臟收縮功能，但移植后惡性心律失常的發(fā)生率明顯增高。研究發(fā)現(xiàn)SKMs移植后在體內(nèi)可以分化成為成熟的骨骼肌樣細(xì)胞，與心肌細(xì)胞不能形成功能性縫隙連接，而在體外培養(yǎng)的未分化的SKMs可與心肌細(xì)胞形成有效電偶聯(lián)。研究顯示MI后心室重塑影響移植后細(xì)胞的分化和增殖。故考慮SKMs移植的致

2、心律失常作用可能與其分化狀態(tài)有關(guān)，改善心室重塑改善移植后細(xì)胞的微環(huán)境可以減少移植后心律失常的發(fā)生。微小RNA-181(microRNA-181，miRNA-181)通過(guò)抑制同源盒蛋白A11(Homeobox-A11，Hox-A11)的表達(dá)促進(jìn)SKMs分化成熟。本研究擬構(gòu)建重組慢病毒載體，敲除miRNA-181，抑制成肌細(xì)胞的分化。觀察分化狀態(tài)對(duì)SKMs的影響，將抑制分化了的SKMs移植到缺血心肌內(nèi)，研究對(duì)心功能和心律失常的影響；進(jìn)一步通

3、過(guò)纈沙坦改善心室重構(gòu)，研究心肌局部微環(huán)境對(duì)移植后SKMs的分化以及心律失常的影響。
　　 方法：
　　 1、對(duì)比研究?jī)煞N不同SKMs培養(yǎng)方法，篩選構(gòu)建高效的SKMs培養(yǎng)體系。
　　 2、設(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)miRNA-181的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)慢病毒表達(dá)載體Lenti-siR-miR181，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代SKMs（慢病毒轉(zhuǎn)染組，Tr組），用抗螢光素酶的慢病毒載體(

4、Lenti-siLUc)作為陰性對(duì)照(Negative controlgroup，Nc組），以等體積的PBS設(shè)為對(duì)照組（Control Group，Cn組）轉(zhuǎn)染SKMs。轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天分別提取全細(xì)胞蛋白、總RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miRNA-181水平，Western blot檢測(cè)Hox-A11蛋白，Real-Time PCR檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)Hox-A11 mRNA水平，以鑒定此重組慢病毒載體的有效性。
　　

5、 3、以此有效病毒載體轉(zhuǎn)染SKMs，用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)SKMs增殖能力影響。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后7天SKMS縫隙連接蛋白(Connexion-43，Cx43)mRNA水平的變化，免疫熒光檢測(cè)SKMs Cx43蛋白的表達(dá)情況。將SKMs與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)，膜片鉗檢測(cè)SKMs對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。免疫熒光法檢測(cè)體外誘導(dǎo)分化

6、培養(yǎng)的SKMs中快反應(yīng)肌球蛋白重鏈(Fast Myosin Heavy Chains，F(xiàn)-MHC)表達(dá)，研究miRNA-181敲除對(duì)體外培養(yǎng)SKMs分化的影響。
　　 4、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制造大鼠心肌梗死模型( n=150)，術(shù)后1周超聲檢測(cè)心功能，隨機(jī)分為3組，梗死心肌邊緣注射移植100μL（共5×106個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液（MI-KO組），用轉(zhuǎn)染Lenti-siLUc的SKMs作為陰性對(duì)照(MI-SKM)，對(duì)照組僅注射100μL P

7、BS（MI-Cn組）。在細(xì)胞移植后2周、1月，分別用超聲學(xué)方法檢測(cè)心功能，在體電生理檢查，程序性電刺激檢測(cè)各組室性心動(dòng)過(guò)速的誘出率。ELASA檢測(cè)各組血清氨基末端腦鈉肽（N-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide，NT-ProBNP）水平，免疫組織化學(xué)檢測(cè)心肌內(nèi)移植細(xì)胞Hox-A11和Cx43的表達(dá)情況。
　　 5、SKMs移植后纈沙坦（20mg/Kg.D-1）干預(yù)以改善心肌重塑，在干預(yù)后2

8、周、1月再次進(jìn)行電生理檢查，研究對(duì)心律失常的影響，免疫組化法觀察梗死邊緣區(qū)心肌膠原表達(dá)情況，Western Blot檢測(cè)Cx43表達(dá)變化，血管密度等對(duì)心肌微環(huán)境的影響，研究心肌微環(huán)境變化對(duì)SKMS移植后心律失常的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、兩種方法獲得的細(xì)胞在純度(91.5±4.1％vs.85.3±5.3％，P=0.062)和細(xì)胞存活度上（90.7±2.9％vs.94±6.1％，P=0.058）沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但組織

9、塊法細(xì)胞純度相對(duì)較低。
　　 2、針對(duì)miRNA-181的重組慢病毒載體Lenti-siR-miR181，可以高效轉(zhuǎn)染SKMs（轉(zhuǎn)染效率最高為82.5％）。轉(zhuǎn)染后3、5、7天，慢病毒轉(zhuǎn)染組(Tr組)的miRNA-181水平較對(duì)照組（Cn組）和陰性對(duì)照組（Nc組）明顯降低（在各時(shí)間點(diǎn)，miRNA-181水平分別為對(duì)照組（Cn組）的60±6.5％，35±3.2％和30±2.4％，P＜0.05)。Hox-A11蛋白水平與轉(zhuǎn)染后1天相比

10、明顯降低(Day3:0.42019±0.0231vs.0.6911±0.0712，P＜0.001),(Day5:0.2157±0.0107vs.0.6911±0.0712,P＜0.001),(Day7:0.0880±0.0211vs.0.6911±0.0712,P＜0.001)。Tr組第5、7天明顯高于對(duì)照組（Cn組）（Day5：0.3807±0.0317vs.0.1803±0.050，P＜0.001；Day7：0.2981±0.017

11、8vs.0.2010±0.0319，P＜0.001）．）而各時(shí)間點(diǎn)Hox-A11mRNA水平無(wú)明顯差異(P=0.071))。
　　 3、MTT結(jié)果顯示：Tr組SKMs的增殖在轉(zhuǎn)染后第3天與Nc組無(wú)明顯差異，但在第7天增殖明顯高于Nc組和Cn組(OD值為Day7:0.91968±0.063vs.0.8206±0.072vs.0.6302±0.059，P＜0.05，P＜0.05)。Tr組轉(zhuǎn)染后7天Cx43蛋白表達(dá)明顯高于Cn組(0.

12、94±0.07vs.0.63±0.09,P＜0.05)。分化培養(yǎng)后7天，敲除miRNA-181的SKMS內(nèi)F-MHC表達(dá)明顯低于Cn組。
　　 4、細(xì)胞移植后2周MI-KO組和MI-SKM組大鼠LVEF明顯高于MI-Cn組，(MI-KOvs.MI-Cn:42.05±3.16％vs.34.17±1.99％，P＜0.05:MI-SKMvs.MI-Cn:41.98±3.7％vs.34.17±2.09％，P＜0.05)，細(xì)胞移植組與移植

13、前相比明顯改善(MI-KO:42.05±3.16％vs.34.17±2.09％,P＜0.05；MI-SKM41.91±2.7％vs.35.1±2.8％，P＜0.05)，這種心功能的改善可持續(xù)到移植后1個(gè)月。移植后SKM移植組，室速的誘出率高達(dá)71％，明顯高于MI-Cn組（P＜0.0I）。在MI-KO組，其室速的誘出率為34％，明顯低于MI-SKM組（P＜0.01），但與MI-Cn組相比沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。而在隨后的1月時(shí)各組間

14、室速的誘出率沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（MI-Cn組：31％，MI-KO:28％，MI-SKM:66％，P=0.062）。
　　 5、纈沙坦干預(yù)2周后，MI-KO組，MI-KO+V組，MI-SKM組，MI-SKM+V組的LVEF明顯高于對(duì)照組(MI-Cn)（移植后14天可見(jiàn)，MI-KOvs.MI-Cn:41.05±3.1％vs.33.9±2.0％,P＜0.05;MI-KO+Vvs.MI-Cn:42.5±2.4％vs．33.9±2.0％

15、;MI-SKMvs.MI-Cn:41.91±2.7％vs.33.9±2.0％,P＜0.05:MI-SKM+Vvs.MI-Cn:42.6±2.0％vs.33.9±2.0％，P＜0.05。移植后1個(gè)月MI-KOvs.MI-Cn:40.35±2.3％vs.34.5±2.5％,P＜0.05;MI-KO+Vvs.MI-Cn:44.1±3.0％vs.34.5±2.5％;MI-SKMvs.MI-Cn:41.6±2.7％vs.34.5±2.5％,P＜0

16、.05;MI-SKM+Vvs.MI-Cn:43.9±2.2％vs.34.5±2.5％，P＜0.05。移植后一個(gè)月可以觀察到纈沙坦處理可以使心臟功能進(jìn)一步改善(MI-KOvs.MI-KO+V:40.35±2.3％vs.44.1±3.0％;MI-SKMvs.MI-SKM+V:41.6±2.7％vs.43.9±2.2％，均P＜0.05)，而在移植后14天時(shí)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞移植后2周纈沙坦處理組(MI-SKM+V組，MI-KO+V組)與相應(yīng)

17、的未處理對(duì)照組（MI-SKM組，MI-KO組）相比，室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但移植后1月纈沙坦處理組室速發(fā)生率為(MI-KO+V29％，)明顯低于未處理組(MI-KO，46％)和對(duì)照組(MI-Cn，64％)。免疫組化顯示纈沙坦處理組梗死邊緣區(qū)Ⅰ型膠原蛋白較對(duì)照組明顯降低，血管密度高于對(duì)照組(Ml-KO+Vvs.MI-KO:148.52±34.57vs.102.31±30.75/mm2,P＜0.05),Cx43蛋白表達(dá)高于對(duì)照

18、組。
　　 結(jié)論：
　　 1、miRNA-181敲除可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞增殖，抑制體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞分化。阻止成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)Cx43的降低。
　　 2、敲除miRNA-181的SKMs在心肌內(nèi)分化減緩，但仍可進(jìn)一步分化成熟，移植后早期心律失常的發(fā)生率明顯降低，對(duì)移植后晚期心律失常無(wú)明顯改善。
　　 3、纈沙坦可以改善心室重塑，改善移植后成肌細(xì)胞的增殖，減少移植后心律失常的發(fā)生，但對(duì)分化無(wú)明顯影響