miR-133b調(diào)控CTGF表達(dá)抑制老年腎間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模耗I間質(zhì)纖維化是腎臟衰老和多種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎臟病的病理學(xué)基礎(chǔ)。腎臟上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)青年、老年大鼠骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞微泡中miR-133b存在差異表達(dá)，并抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究進(jìn)一步探討miR-133b調(diào)控老年腎間質(zhì)纖維化的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：采

2、用RT-PCR檢測(cè)在不同濃度(0、6、8、10ng/ml)和不同時(shí)間(0、24、48、72h)TGF-β1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中miR-133b的表達(dá)變化;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-133b靶基因。體外實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染miR-133bHK2細(xì)胞，TGF-β1刺激下miR-133b靶基因和E-cadherin、α-SMA、FN及Col3A1的mRNA和蛋白表達(dá)情況;上調(diào)HK2細(xì)胞miR-133b靶基因的表達(dá)，通過檢測(cè)上述指標(biāo)進(jìn)一步證實(shí)

3、證實(shí)miR-133b抑制HK2細(xì)胞EMT的靶基因。構(gòu)建老年小鼠UUO模型，利用轉(zhuǎn)染試劑尾靜脈注射miR-133b，第7、14天檢測(cè)腎組織miR-133b和靶基因以及上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)和腎間質(zhì)纖維化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：miR-133b的表達(dá)隨著TGF-β1作用濃度的增加和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，濃度為8ng/ml干預(yù)時(shí)間為48h時(shí)miR-133b的表達(dá)下調(diào)最明顯(p＜0.01)。轉(zhuǎn)染miR-133b mimic能下調(diào)CTGF的表達(dá)(

4、p＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miRNA mimic control對(duì)CTGF的表達(dá)無影響，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)CTGF為miR-133b的直接作用靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)染miR-133b mimic能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的下調(diào)(p＜0.05)，以及a-SMA、FN和Col3A1的上調(diào)(p＜0.05)。過表達(dá)靶基因CTGF可以逆轉(zhuǎn)miR-133b對(duì)EMT的抑制作用。在注入miRNA-133b過表達(dá)轉(zhuǎn)染復(fù)合物后