miR-133b調(diào)控CTGF表達抑制老年腎間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、實驗目的：腎間質(zhì)纖維化是腎臟衰老和多種腎臟疾病進展到終末期腎臟病的病理學基礎(chǔ)。腎臟上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)青年、老年大鼠骨髓來源間充質(zhì)干細胞微泡中miR-133b存在差異表達，并抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。本研究進一步探討miR-133b調(diào)控老年腎間質(zhì)纖維化的作用靶點及機制。
　　實驗方法：采

2、用RT-PCR檢測在不同濃度(0、6、8、10ng/ml)和不同時間(0、24、48、72h)TGF-β1誘導HK2細胞轉(zhuǎn)分化過程中miR-133b的表達變化;雙熒光素酶報告基因檢測miR-133b靶基因。體外實驗觀察轉(zhuǎn)染miR-133bHK2細胞，TGF-β1刺激下miR-133b靶基因和E-cadherin、α-SMA、FN及Col3A1的mRNA和蛋白表達情況;上調(diào)HK2細胞miR-133b靶基因的表達，通過檢測上述指標進一步證實

3、證實miR-133b抑制HK2細胞EMT的靶基因。構(gòu)建老年小鼠UUO模型，利用轉(zhuǎn)染試劑尾靜脈注射miR-133b，第7、14天檢測腎組織miR-133b和靶基因以及上述指標的蛋白表達和腎間質(zhì)纖維化。
　　實驗結(jié)果：miR-133b的表達隨著TGF-β1作用濃度的增加和干預時間的延長而逐漸降低，濃度為8ng/ml干預時間為48h時miR-133b的表達下調(diào)最明顯(p＜0.01)。轉(zhuǎn)染miR-133b mimic能下調(diào)CTGF的表達(

4、p＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miRNA mimic control對CTGF的表達無影響，雙熒光素酶報告基因檢測證實CTGF為miR-133b的直接作用靶點。轉(zhuǎn)染miR-133b mimic能夠抑制TGF-β1誘導HK2細胞上皮標記蛋白E-cadherin的下調(diào)(p＜0.05)，以及a-SMA、FN和Col3A1的上調(diào)(p＜0.05)。過表達靶基因CTGF可以逆轉(zhuǎn)miR-133b對EMT的抑制作用。在注入miRNA-133b過表達轉(zhuǎn)染復合物后