MiR-181a-5p靶向抑制Egr1延緩糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化.pdf

1、目的和意義:
　　腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis，TIF）在糖尿病腎?。―iabeteicnephropathy,DN）腎纖維化過(guò)程中扮演著十分重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(early growth response factor1，Egr1)在DN腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，但潛在機(jī)制不明確，并且尚不明確Egr1在DN中是否調(diào)控TIF。
　　微小RNA（microRNA

2、,miRNA）作為一種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與靶基因的3'端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)的直接結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)。研究證實(shí)在DN腎纖維化過(guò)程中，多種miRNA均發(fā)揮著十分重要的作用。但何種miRNA可以靶向調(diào)節(jié)Egr1的表達(dá)調(diào)控TIF尚不明確。
　　本課題開(kāi)展了體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)兩部分。旨在探討:1、在DN腎纖維化過(guò)程中，Egr1對(duì)TIF是否發(fā)揮作用。2、鎖定Egr1的上游調(diào)控因子miR-181a-5

3、p。3、驗(yàn)證miR-181a-5p是否靶向抑制Egr1的表達(dá)延緩TIF。希望通過(guò)本研究為深入理解DN的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、選取雄性O(shè)LETF大鼠構(gòu)建DN動(dòng)物模型，LETO大鼠為對(duì)照組，PAS染色和Masson染色檢測(cè)40周齡大鼠腎臟的病理變化。免疫組化檢測(cè)大鼠腎組織Egr1、TGF-β1的表達(dá)。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ m

4、RNA和蛋白的表達(dá)。
　　2、HK-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pENTER-Egr1或siEgr1，qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3、高糖及高滲培養(yǎng)液孵育HK-2細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Egr1mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　4、生物信息學(xué)網(wǎng)站篩選靶向調(diào)節(jié)Egr1的miRNA。高糖培養(yǎng)基孵育HK-2細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)篩選

5、出的miRNA，鎖定miR-181a-5p。qRT-PCR檢測(cè)大鼠腎組織miR-181a-5p mRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-181 a-5p對(duì)Egr1的靶向調(diào)控作用。
　　5、HK-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics或inhibitor，qRT-PCR和Westernblot檢測(cè) Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠmRNA和蛋白的表達(dá)。
　　6、HK-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siEgr1、miR-181

6、 a-5p inhibitor或siEgr1+ miR-181a-5pinhibitor，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、40周齡的OLETF大鼠腎組織已經(jīng)呈現(xiàn)DN腎纖維化的病理特征，并且Egr1和TGF-β1表達(dá)明顯上調(diào)，Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯增加。
　　2、HK-2細(xì)胞中，過(guò)表

7、達(dá)Egr1使Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào);沉默Egr1使Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　3、HK-2細(xì)胞中，高糖孵育使Egr1 mRNA及蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性變化的特點(diǎn)。高滲孵育使Egr1基因表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　4、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)初步鎖定了9個(gè)miRNAs。HK-2細(xì)胞中，高糖孵育使miR-181a-5p mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性變化

8、，且與Egr1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān);高滲孵育使miR-181 a-5p mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。40周OLETF大鼠腎組織中miR-181a-5p mRNA表達(dá)明顯下降。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-181a-5p與Egr13'UTR靶向結(jié)合。
　　5、HK-2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-181a-5p使Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào);沉默miR-181a-5p使Egr1、TGF-β1、FN和CO

9、LⅠ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。
　　6、HK-2細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染siEgr1+ miR-181a-5p inhibitor可以回復(fù)沉默Egr1基因表達(dá)引起的Egr1、TGF-β1、FN和COLⅠ mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、40周齡的OLETF大鼠腎組織呈現(xiàn)DN腎纖維化的病理特點(diǎn)。
　　2、HK-2細(xì)胞中，Egr1通過(guò)上調(diào)TGF-β1增加ECM的合成。
　　3、miR-181a-5p與