三種赤潮藻毒素液態(tài)芯片檢測法的建立.pdf

1、赤潮是襲擾許多沿海國家的一種常見的海洋災(zāi)害，已引起全世界的高度重視。赤潮藻毒素是指由有毒赤潮生物產(chǎn)生的具有毒副作用的天然有機(jī)化合物。其成分復(fù)雜，依據(jù)中毒后癥狀，毒素傳遞媒介類型及危害性較大等因素綜合考慮，赤潮藻毒素可分為五大類。
　　 普通免疫檢測由于受到檢測介質(zhì)和設(shè)備的限制，通常只能實現(xiàn)樣品的單項檢測。對于成分復(fù)雜的樣品，工作人員只能采取反復(fù)檢測的手段，耗費了大量的時間和人力。而液態(tài)芯片系統(tǒng)則可以實現(xiàn)赤潮藻毒素高通量免疫檢測。

2、在節(jié)約了檢測時間的同時也保證了檢測的準(zhǔn)確性。
　　 本文采用活性酯法和一步甲醛法合成三種赤潮藻毒素的完全抗原；并利用大田軟海綿酸(okadaicacid，OA)與BSA的偶聯(lián)物OA-BSA作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，成果制備了鼠抗大田軟海綿酸(OA)單克隆抗體。隨后將三種毒素的包被抗原偶聯(lián)于液態(tài)芯片檢測載體--編碼微球上。經(jīng)過偶聯(lián)確證，證實三種赤潮抗原結(jié)合物的偶聯(lián)成功。在此基礎(chǔ)上，對每孔單項微球加入數(shù)、特異性生物素化抗體加

3、入量以及反應(yīng)時間等幾個重要的實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化，建立3種赤潮藻毒素單通道檢測的液態(tài)芯片單通道檢測方法，分別繪制出了3種赤潮藻毒素單通道液態(tài)芯片檢測的Logistic回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線關(guān)系良好。且三種赤潮藻毒素的單通道檢測方法具有操作簡單、靈敏度高、反應(yīng)快速等特點。該方法針對檢測OA的有效線性檢測范圍為0.2～63μg/L，檢測限約為0.129μg/L；針對檢測STX效線性檢測范圍為5.04～639.58μ

4、g/L，檢測限約為4.802μg/L；而針對檢測DA效線性檢測范圍為6.58～761.558μg/L，檢測限約為6.25μg/L；
　　 本文另一個重要研究是將R-藻紅蛋白對多種赤潮藻毒素單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，從而達(dá)到簡化檢測步驟，最大程度的縮減檢測耗時。通過熒光物質(zhì)直接連接單克隆抗體方法所建立起來的直標(biāo)法液態(tài)芯片檢測技術(shù)較一般的液態(tài)芯片檢測法檢測時間縮短了近一半。同時保證了一定的靈敏度。該方法針對檢測OA的有效線性檢測范圍為1.

5、32～96.87μg/L，檢測限約為1.23μg/L；針對檢測STX效線性檢測范圍為13.34～590.79μg/L，檢測限約為12.31μg/L；而針對檢測DA效線性檢測范圍為12.30～435.56μg/L，檢測限約為11.52μg/L；在單通道檢測法建立的基礎(chǔ)上，依次進(jìn)行3項赤潮藻毒素同步常規(guī)法和直標(biāo)法檢測的高通量分析。結(jié)果表明，3項赤潮藻毒素同步常規(guī)法針對檢測OA的有效線性檢測范圍為0.186～94.857μg/L，檢測限約為0

6、.146μg/L；針對檢測STX效線性檢測范圍為5.45～707.78μg/L，檢測限約為5.12μg/L；而針對檢測DA效線性檢測范圍為6.68～696.55μg/L，檢測限約為6.35μg/L；而3項赤潮藻毒素同步直標(biāo)法針對檢測OA的有效線性檢測范圍為1.45～128.27μg/L，檢測限約為1.33μg/L；針對檢測STX效線性檢測范圍為13.67～753.46μg/L，檢測限約為12.89μg/L；而針對檢測DA效線性檢測范圍為

7、10.26～368.38μg/L，檢測限約為9.614μg/L；在液態(tài)芯片高通量的特異度方面，液態(tài)芯片的檢測特異度測試良好。在對含有三種赤潮藻毒素不同樣品的檢測中，實測值與實際濃度的相對偏差較小，說明液態(tài)芯片系統(tǒng)可用于對多赤潮藻毒素實際樣品進(jìn)行快速檢測。其中常規(guī)的檢測過程耗時1.5h，而直標(biāo)法僅需45min。兩種方法基本上滿足多赤潮藻毒素檢測的靈敏性、快速性和高通量的需求。
　　 與采用傳統(tǒng)的常規(guī)間接競爭ELISA法檢測的三種赤