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1、本研究以γ-氨基丁酸和農(nóng)藥中間體為原料合成了甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷和甲基毒死蜱三種有機(jī)磷農(nóng)藥人工半抗原O-甲基-0-(4.硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(HI)、O-甲基-O-(3-甲基,4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(H2)和O-甲基-0-(3,5,6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(H3),利用4-溴代丁酸乙酯和農(nóng)藥中間體為原料合成了另外三種半抗原4.硝基苯基-O-丁酸(H4),3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸(H5)和
2、3,5,6-三氯吡啶基-O-丁酸(H6);通過活潑酯法將H1、H2和H3分別交聯(lián)于牛血清白蛋白(BSA)上制備免疫原,將H1、H2、H3、 H4、H5和H6分別交聯(lián)于卵清蛋白( OVA)上制備包被原。 以等量混合的H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA制成的混合免疫原HA-BSA混合免疫BALB/c小鼠,采用常規(guī)雜交瘤技術(shù),用PEG法將其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,經(jīng)ELISA法篩選及有限稀釋法亞克隆化,建立可穩(wěn)
3、定分泌分別抗甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷和甲基毒死蜱的雜交瘤細(xì)胞株。結(jié)果獲得了一株可穩(wěn)定分泌抗甲基對(duì)硫磷的雜交瘤細(xì)胞株(3H9/A3),兩株可穩(wěn)定分泌抗殺螟硫磷的雜交瘤細(xì)胞株(3H9/B3、6C8/H6),一株可穩(wěn)定分泌抗甲基毒死蜱的雜交瘤細(xì)胞株(3G7/F5),所分泌的抗體類型及亞類均為IgG1,輕鏈均為k鏈,通過對(duì)抗體效價(jià)的檢測(cè)比較,選用3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5三株細(xì)胞株作進(jìn)一步研究,三者所分泌的抗體親和常數(shù)分別達(dá)1.23×
4、108L/mol、2.0×107L/mol和3.09×108L/mol.細(xì)胞株3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5所分泌的抗體分別對(duì)甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷和甲基毒死蜱具有明顯的識(shí)別作用,為建立三種農(nóng)藥的殘留分析奠定了基礎(chǔ)。 以雜交瘤細(xì)胞株3H9/A3、6C8/H6、3G7/F5分泌的單克隆抗體為基礎(chǔ),通過對(duì)檢測(cè)體系中鹽封閉物、離子強(qiáng)度、pH值等影響因子的研究建立了甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷以及甲基毒死蜱的ELISA檢測(cè)體系.以Log
5、it(B/Bo)作縱坐標(biāo)與農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)值作橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,甲基對(duì)硫磷在0.01μg/ml~10μg/ml范圍內(nèi)呈顯著線性關(guān)系,檢測(cè)方程為y=-1.02x-0.9894,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9744,IC50為0.107μg/ml,在土壤、自來(lái)水以及青菜中的添加回收率分別為84.3%、93.9%、100.5%;殺螟硫磷在0.001ng/ml~100ng/ml范圍內(nèi)呈顯著線性關(guān)系,檢測(cè)方程為y=-0.4421x-0.5681,相關(guān)系數(shù)R
6、2達(dá)0.9947,IC50為0.052ng/ml,在土壤、自來(lái)水以及青菜中的添加回收率分別為84.5%、99.05%、94.9%;甲基毒死蜱在0.01μg/ml~100μg/ml范圍內(nèi)呈顯著線性關(guān)系,檢測(cè)方程為y=-0.9476x-1.0641,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9951,IC50為0.075μg/ml在土壤、自來(lái)水以及青菜中的添加回收率分別為85.1%、104.8%、90.2%.本研究采用混合免疫方法在一次細(xì)胞融合過程中獲得了三種單克
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