三種有機磷農(nóng)藥殘留免疫檢測方法的建立與應用.pdf

1、本研究以γ-氨基丁酸和農(nóng)藥中間體為原料合成了甲基對硫磷、殺螟硫磷和甲基毒死蜱三種有機磷農(nóng)藥人工半抗原O-甲基-0-(4.硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(HI)、O-甲基-O-(3-甲基，4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(H2)和O-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(H3)，利用4-溴代丁酸乙酯和農(nóng)藥中間體為原料合成了另外三種半抗原4.硝基苯基-O-丁酸(H4)，3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸(H5)和

2、3，5，6-三氯吡啶基-O-丁酸(H6)；通過活潑酯法將H1、H2和H3分別交聯(lián)于牛血清白蛋白(BSA)上制備免疫原，將H1、H2、H3、 H4、H5和H6分別交聯(lián)于卵清蛋白( OVA)上制備包被原。 以等量混合的H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA制成的混合免疫原HA-BSA混合免疫BALB/c小鼠，采用常規(guī)雜交瘤技術，用PEG法將其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，經(jīng)ELISA法篩選及有限稀釋法亞克隆化，建立可穩(wěn)

3、定分泌分別抗甲基對硫磷、殺螟硫磷和甲基毒死蜱的雜交瘤細胞株。結(jié)果獲得了一株可穩(wěn)定分泌抗甲基對硫磷的雜交瘤細胞株(3H9/A3)，兩株可穩(wěn)定分泌抗殺螟硫磷的雜交瘤細胞株(3H9/B3、6C8/H6)，一株可穩(wěn)定分泌抗甲基毒死蜱的雜交瘤細胞株(3G7/F5)，所分泌的抗體類型及亞類均為IgG1，輕鏈均為k鏈，通過對抗體效價的檢測比較，選用3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5三株細胞株作進一步研究，三者所分泌的抗體親和常數(shù)分別達1.23×

4、108L/mol、2.0×107L/mol和3.09×108L/mol.細胞株3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5所分泌的抗體分別對甲基對硫磷、殺螟硫磷和甲基毒死蜱具有明顯的識別作用，為建立三種農(nóng)藥的殘留分析奠定了基礎。 以雜交瘤細胞株3H9/A3、6C8/H6、3G7/F5分泌的單克隆抗體為基礎，通過對檢測體系中鹽封閉物、離子強度、pH值等影響因子的研究建立了甲基對硫磷、殺螟硫磷以及甲基毒死蜱的ELISA檢測體系.以Log

5、it(B/Bo)作縱坐標與農(nóng)藥濃度的對數(shù)值作橫坐標建立標準曲線，甲基對硫磷在0.01μg/ml～10μg/ml范圍內(nèi)呈顯著線性關系，檢測方程為y=-1.02x-0.9894，相關系數(shù)R2達0.9744，IC50為0.107μg/ml，在土壤、自來水以及青菜中的添加回收率分別為84.3％、93.9％、100.5％；殺螟硫磷在0.001ng/ml～100ng/ml范圍內(nèi)呈顯著線性關系，檢測方程為y=-0.4421x-0.5681，相關系數(shù)R

6、2達0.9947，IC50為0.052ng/ml，在土壤、自來水以及青菜中的添加回收率分別為84.5％、99.05％、94.9％；甲基毒死蜱在0.01μg/ml～100μg/ml范圍內(nèi)呈顯著線性關系，檢測方程為y=-0.9476x-1.0641，相關系數(shù)R2達0.9951，IC50為0.075μg/ml在土壤、自來水以及青菜中的添加回收率分別為85.1％、104.8％、90.2％.本研究采用混合免疫方法在一次細胞融合過程中獲得了三種單克