建立幾種赤潮藻的PCR–膜反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)技術(shù).pdf

1、赤潮藻的鑒定和檢測(cè)是進(jìn)行赤潮研究和預(yù)警的前提和基礎(chǔ),因此其方法學(xué)成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。然而,基于形態(tài)學(xué)特征的傳統(tǒng)赤潮藻的鑒定方法(光鏡法)效率低、準(zhǔn)確度不高,特別是不能對(duì)自然水樣中的多赤潮藻進(jìn)行并行檢測(cè)。因此,本文擬建立一種可同時(shí)檢測(cè)多種赤潮藻的分子技術(shù)—PCR–膜反向斑點(diǎn)雜交。
　　研究選取了6中常見(jiàn)的赤潮藻,包括東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、共生甲藻(Symbiodiniumsp.)、赤潮

2、異灣藻(Heterosigmaakashiwo)、熱帶條藻(Skeletonematropicum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)和新月菱形藻(Nitzschia closterium)為研究對(duì)象,首先通過(guò)提取基因組DNA,對(duì)其核糖體大亞基rDNA序列的D1–D2區(qū)(LSUD1–D2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;然后將PCR產(chǎn)物純化回收,再將純化后的PCR產(chǎn)物與載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中進(jìn)行克隆,通過(guò)藍(lán)白斑篩選,獲

3、得陽(yáng)性克隆菌株并進(jìn)行商業(yè)測(cè)序。
　　根據(jù)測(cè)序結(jié)果,采用ArrayDesigner4.20設(shè)計(jì)獲得了各自的特異性分類探針,并通過(guò)Oligo軟件對(duì)探針進(jìn)行評(píng)價(jià),初步篩選出針對(duì)各種赤潮藻的備選探針3條;采用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)出通用擴(kuò)增引物;用反向斑點(diǎn)雜交對(duì)探針進(jìn)行初篩,得到各赤潮藻的探針1條;將探針進(jìn)行地高辛(Digoxigenin,DIG)標(biāo)記,選用6種常見(jiàn)赤潮藻及其它常見(jiàn)微藻,通過(guò)正向斑點(diǎn)雜交對(duì)探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證

4、。
　　對(duì)探針進(jìn)行加尾,并用其制備低密度膜芯片,采用DIG標(biāo)記法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記,初步建立了基于LSUrDNA的PCR–膜反向斑點(diǎn)雜交體系,并進(jìn)一步對(duì)膜制備和雜交體系,包括探針用量、DIG標(biāo)記PCR產(chǎn)物的用量、紫外交聯(lián)時(shí)間、雜交溫度、雜交時(shí)間和洗滌時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:設(shè)計(jì)的探針具有特異性;最終的優(yōu)化條件為:探針上樣量>5pmol,DIG標(biāo)記PCR產(chǎn)物>25ng,紫外交聯(lián)30s,42℃雜交2h,47℃洗膜2×5min。

5、r>　　為了驗(yàn)證PCR–膜反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)法的實(shí)用性,分別用不同濃度及不同固定時(shí)間的模擬自然水樣及自然水樣作為樣品,分別進(jìn)行PCR–膜反向斑點(diǎn)雜交測(cè)試。結(jié)果表明:PCR–膜反向斑點(diǎn)雜交的檢測(cè)極限為0.1cell/ml;含有6種目標(biāo)藻混合藻液用魯哥氏液固定1、3、5、10、15和30d后均能檢測(cè)到6種微藻;該方法能成功檢測(cè)到自然樣品的目標(biāo)藻種,其結(jié)果與光鏡鏡檢結(jié)果一致。
　　最后,本研究還對(duì)10種赤潮藻的ITS序列進(jìn)行了克隆,并根據(jù)