建立幾種赤潮藻的PCR–膜反向斑點雜交檢測技術(shù).pdf

1、赤潮藻的鑒定和檢測是進行赤潮研究和預(yù)警的前提和基礎(chǔ),因此其方法學成為當前國內(nèi)外研究的熱點。然而,基于形態(tài)學特征的傳統(tǒng)赤潮藻的鑒定方法(光鏡法)效率低、準確度不高,特別是不能對自然水樣中的多赤潮藻進行并行檢測。因此,本文擬建立一種可同時檢測多種赤潮藻的分子技術(shù)—PCR–膜反向斑點雜交。
　　研究選取了6中常見的赤潮藻,包括東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、共生甲藻(Symbiodiniumsp.)、赤潮

2、異灣藻(Heterosigmaakashiwo)、熱帶條藻(Skeletonematropicum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)和新月菱形藻(Nitzschia closterium)為研究對象,首先通過提取基因組DNA,對其核糖體大亞基rDNA序列的D1–D2區(qū)(LSUD1–D2)進行PCR擴增;然后將PCR產(chǎn)物純化回收,再將純化后的PCR產(chǎn)物與載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中進行克隆,通過藍白斑篩選,獲

3、得陽性克隆菌株并進行商業(yè)測序。
　　根據(jù)測序結(jié)果,采用ArrayDesigner4.20設(shè)計獲得了各自的特異性分類探針,并通過Oligo軟件對探針進行評價,初步篩選出針對各種赤潮藻的備選探針3條;采用PrimerPremier5.0設(shè)計出通用擴增引物;用反向斑點雜交對探針進行初篩,得到各赤潮藻的探針1條;將探針進行地高辛(Digoxigenin,DIG)標記,選用6種常見赤潮藻及其它常見微藻,通過正向斑點雜交對探針的特異性進行驗證

4、。
　　對探針進行加尾,并用其制備低密度膜芯片,采用DIG標記法對PCR產(chǎn)物進行標記,初步建立了基于LSUrDNA的PCR–膜反向斑點雜交體系,并進一步對膜制備和雜交體系,包括探針用量、DIG標記PCR產(chǎn)物的用量、紫外交聯(lián)時間、雜交溫度、雜交時間和洗滌時間等進行優(yōu)化。結(jié)果表明:設(shè)計的探針具有特異性;最終的優(yōu)化條件為:探針上樣量>5pmol,DIG標記PCR產(chǎn)物>25ng,紫外交聯(lián)30s,42℃雜交2h,47℃洗膜2×5min。

5、r>　　為了驗證PCR–膜反向斑點雜交檢測法的實用性,分別用不同濃度及不同固定時間的模擬自然水樣及自然水樣作為樣品,分別進行PCR–膜反向斑點雜交測試。結(jié)果表明:PCR–膜反向斑點雜交的檢測極限為0.1cell/ml;含有6種目標藻混合藻液用魯哥氏液固定1、3、5、10、15和30d后均能檢測到6種微藻;該方法能成功檢測到自然樣品的目標藻種,其結(jié)果與光鏡鏡檢結(jié)果一致。
　　最后,本研究還對10種赤潮藻的ITS序列進行了克隆,并根據(jù)