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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE B-3,觀察TGF-β2對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響。
2、觀察不同濃度的NF-κB p65ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響。
3、通過應(yīng)用NF-κB p65ASODN在體外轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)由TGF-β2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響,研究NF-κB p65ASODN在體外對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響。
2、 4、采用眼前房內(nèi)注射法轉(zhuǎn)移NF-κB p65ASODN至新西蘭大白兔后發(fā)性白內(nèi)障模型眼內(nèi),觀察其對(duì)后發(fā)性白內(nèi)障的作用,探討后發(fā)性白內(nèi)障的基因治療方法。
方法:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE B-3,用不同濃度的TGF-β2處理后,在不同的時(shí)間點(diǎn)用細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞的移行能力,ELISA法處理細(xì)胞爬片后,檢測(cè)細(xì)胞爬片中的陽性細(xì)胞數(shù)和吸光度值,檢測(cè)α-SMA蛋白的變化。
2、將NF-κB p65ASODN行全程硫
3、代磷酸化修飾,不同濃度的NF-κB p65ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect兩兩混合,探討細(xì)胞活性不受明顯影響的情況下,最佳的轉(zhuǎn)染效率時(shí)所需的NF-κB p65ASODN的濃度和轉(zhuǎn)染劑的劑量。
3、細(xì)胞同步培養(yǎng)后分五組:(1)空白對(duì)照組(單純FSM培養(yǎng)),(2)陰性對(duì)照組(HiPerFect轉(zhuǎn)染試加入到FSM中共同培養(yǎng)),(3)TGF-β2組(T組)(10ng/ml TGF-β2),(4)TGF-β2加ASODN組
4、(T+A組)(TGF-β2、HiPerFect轉(zhuǎn)染試和ASODN加入到FSM中共同培養(yǎng)),(5)TGF-β2加MSODN組(T+M組)(TGF-β2、HiPerFect轉(zhuǎn)染試和MSODN加入到FSM中共同培養(yǎng))。不同組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),6h、12h、24h、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集上清液檢測(cè)α-SMA的含量,采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞NF-κB mRNA的表達(dá)情況。
4、將16只新西蘭大白兔進(jìn)行晶狀體囊外摘除術(shù)制作后發(fā)障活體眼動(dòng)物模
5、型,手術(shù)后隨即分為四組,每組4只。A組:空白對(duì)照組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射BSS液100ul;B組:陰性對(duì)照組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul;C組:ASODN一次注射組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul;D組:ASODN兩次注射組4只白兔8眼:術(shù)畢和術(shù)后第2天分別經(jīng)側(cè)切口向前
6、房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul。術(shù)后第7、14、21、28天用超聲角膜測(cè)厚儀測(cè)量中央角膜厚度,用裂隙燈顯微鏡觀察前房炎癥反應(yīng)和后囊膜的混濁情況,并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)行HE染色觀察后囊膜的病理變化、檢測(cè)α-SMA的表達(dá)和進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞中NF-κB p65mRNA的表達(dá)。
結(jié)果:1、TGF-β2是晶狀體上皮細(xì)胞重要的促移行和轉(zhuǎn)分化生長因子,其作用
7、呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性。不同濃度的TGF-β2作用48h后,移行距離隨著TGF-β2濃度的增加而增加,當(dāng)濃度為10ng/ml時(shí)作用最強(qiáng);晶狀體上皮細(xì)胞在10ng/ml TGF-β2作用下,其移行距離隨著作用時(shí)間的延長而增加,在48h達(dá)到高峰。晶狀體上皮細(xì)胞在TGF-β2作用下由單層立方形變?yōu)殚L梭形,伸出偽足,逐漸呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣形態(tài)。不同濃度的TGF-β2作用48h后,細(xì)胞爬片中α-SMA的陽性細(xì)胞數(shù)和吸光度值隨著TGF-β2濃度的增
8、加而增加,當(dāng)濃度為10ng/ml時(shí)數(shù)值最大;晶狀體上皮細(xì)胞在10ng/ml TGF-β2作用下,細(xì)胞爬片中α-SMA的陽性細(xì)胞數(shù)和吸光度值隨著作用時(shí)間的延長而增加,在48h達(dá)到最大值。
2、NF-κB p65ASODN對(duì)HLE B-3細(xì)胞的導(dǎo)入率隨時(shí)間的延長而增加,48h導(dǎo)入率可達(dá)60%以上,并且細(xì)胞的活性不受影響;隨著濃度增加,NF-κB p65ASODN對(duì)HLE B-3細(xì)胞的導(dǎo)入率增加,10μg/ml的轉(zhuǎn)染率最高,再增加濃
9、度轉(zhuǎn)染率增加不明顯,對(duì)細(xì)胞活性影響不明顯;當(dāng)劑量≤3ul時(shí),隨著轉(zhuǎn)染劑HiPerFect的增加,對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率增加,無明顯細(xì)胞毒性,當(dāng)劑量增加為4u時(shí),對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率增加不明顯,并且表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。HiPerFect的劑量為3ul,ASODN的濃度為10nmol/L對(duì)細(xì)胞存活率影響小(80.4%),同時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70.8%,為最理想轉(zhuǎn)染條件。
3、在6h、12h、24h、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組
10、、T組、T+A組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與陰性對(duì)照組相比,T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與陰性對(duì)照組相比,T+A組上清液α-SMA的濃度增加不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與T+A組相比,T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);T組與T+M組上清液α-SMA的濃度之間的差異不
11、明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NF-κB p65mRNA出現(xiàn)在364bp處。6h、12h、24h、48h四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組、T組、T+A組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與陰性對(duì)照組相比,T組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與陰性對(duì)照組相比,T+A組NF-κB p65mRNA的含量增加不明
12、顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與T+A組相比,T組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);T組與T+M組NF-κB p65mRNA的含量之間的差異不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
4、眼前節(jié)炎癥反應(yīng)均在一周內(nèi)消失,組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后1周左右,A、B組開始出現(xiàn)后囊膜混濁,隨時(shí)間延長而逐漸加重,C、D組后囊混濁發(fā)生時(shí)間均遲于A、B組,混濁程度也較A、B組為輕,
13、差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色后觀察到A、B組后囊表面可見多層成纖維細(xì)胞生長,細(xì)胞排列較為緊密,囊袋周邊部皮質(zhì)增生,同時(shí)可見明顯纖維素樣物質(zhì)沉積,C、D組后囊表面相對(duì)干凈,僅有少量細(xì)胞增殖,細(xì)胞排列較為疏松。A、B組后囊膜α-SMA的表達(dá)量較C、D組明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組和B組之間,C組和D組之間差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B組NF-κB p65mRN
14、A的表達(dá)量較C、D組明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組和B組之間,C組和D組之間差異不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:1、TGF-β2可促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞的移行,同時(shí)反應(yīng)細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的α-SMA蛋白的表達(dá)增加,應(yīng)用TGF-β2刺激體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞可成功建立后發(fā)障的細(xì)胞模型。
2、HiPerFect的劑量為3ul,ASODN的濃度為10nmol/L對(duì)細(xì)胞存活率影響小(80.4%),同時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70.8
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