核因子Kappa-B p65反義寡核苷酸對人晶狀體上皮細胞移行和轉分化的影響及其抑制后發(fā)性白內障的實驗研究.pdf

1、目的:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLE B-3，觀察TGF-β2對晶狀體上皮細胞的移行和轉分化的影響。
　　2、觀察不同濃度的NF-κB p65ASODN和不同劑量的轉染劑HiPerFect對晶狀體上皮細胞的影響。
　　3、通過應用NF-κB p65ASODN在體外轉染人晶狀體上皮細胞，檢測其對由TGF-β2誘導的晶狀體上皮細胞的移行和轉分化的影響，研究NF-κB p65ASODN在體外對晶狀體上皮細胞的影響。
　

2、　4、采用眼前房內注射法轉移NF-κB p65ASODN至新西蘭大白兔后發(fā)性白內障模型眼內，觀察其對后發(fā)性白內障的作用，探討后發(fā)性白內障的基因治療方法。
　　方法:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLE B-3，用不同濃度的TGF-β2處理后，在不同的時間點用細胞劃痕法觀察細胞的移行能力，ELISA法處理細胞爬片后，檢測細胞爬片中的陽性細胞數和吸光度值，檢測α-SMA蛋白的變化。
　　2、將NF-κB p65ASODN行全程硫

3、代磷酸化修飾，不同濃度的NF-κB p65ASODN和不同劑量的轉染劑HiPerFect兩兩混合，探討細胞活性不受明顯影響的情況下，最佳的轉染效率時所需的NF-κB p65ASODN的濃度和轉染劑的劑量。
　　3、細胞同步培養(yǎng)后分五組:(1)空白對照組（單純FSM培養(yǎng)），(2)陰性對照組(HiPerFect轉染試加入到FSM中共同培養(yǎng))，(3)TGF-β2組（T組）(10ng/ml TGF-β2)，(4)TGF-β2加ASODN組

4、（T+A組）(TGF-β2、HiPerFect轉染試和ASODN加入到FSM中共同培養(yǎng))，(5)TGF-β2加MSODN組（T+M組）(TGF-β2、HiPerFect轉染試和MSODN加入到FSM中共同培養(yǎng))。不同組細胞繼續(xù)培養(yǎng)，6h、12h、24h、48h四個不同時間點收集上清液檢測α-SMA的含量，采用RT-PCR檢測細胞NF-κB mRNA的表達情況。
　　4、將16只新西蘭大白兔進行晶狀體囊外摘除術制作后發(fā)障活體眼動物模

5、型，手術后隨即分為四組，每組4只。A組:空白對照組4只白兔8眼:術畢經側切口向前房注射BSS液100ul;B組:陰性對照組4只白兔8眼:術畢經側切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul;C組:ASODN一次注射組4只白兔8眼:術畢經側切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul;D組:ASODN兩次注射組4只白兔8眼:術畢和術后第2天分別經側切口向前

6、房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul。術后第7、14、21、28天用超聲角膜測厚儀測量中央角膜厚度，用裂隙燈顯微鏡觀察前房炎癥反應和后囊膜的混濁情況，并于實驗結束時行HE染色觀察后囊膜的病理變化、檢測α-SMA的表達和進行RT-PCR檢測晶狀體上皮細胞中NF-κB p65mRNA的表達。
　　結果:1、TGF-β2是晶狀體上皮細胞重要的促移行和轉分化生長因子，其作用

7、呈現明顯的濃度和時間依賴性。不同濃度的TGF-β2作用48h后，移行距離隨著TGF-β2濃度的增加而增加，當濃度為10ng/ml時作用最強;晶狀體上皮細胞在10ng/ml TGF-β2作用下，其移行距離隨著作用時間的延長而增加，在48h達到高峰。晶狀體上皮細胞在TGF-β2作用下由單層立方形變?yōu)殚L梭形，伸出偽足，逐漸呈現纖維細胞樣形態(tài)。不同濃度的TGF-β2作用48h后，細胞爬片中α-SMA的陽性細胞數和吸光度值隨著TGF-β2濃度的增

8、加而增加，當濃度為10ng/ml時數值最大;晶狀體上皮細胞在10ng/ml TGF-β2作用下，細胞爬片中α-SMA的陽性細胞數和吸光度值隨著作用時間的延長而增加，在48h達到最大值。
　　2、NF-κB p65ASODN對HLE B-3細胞的導入率隨時間的延長而增加，48h導入率可達60％以上，并且細胞的活性不受影響;隨著濃度增加，NF-κB p65ASODN對HLE B-3細胞的導入率增加，10μg/ml的轉染率最高，再增加濃

9、度轉染率增加不明顯，對細胞活性影響不明顯;當劑量≤3ul時，隨著轉染劑HiPerFect的增加，對細胞的轉染率增加，無明顯細胞毒性，當劑量增加為4u時，對細胞的轉染率增加不明顯，并且表現出細胞毒性。HiPerFect的劑量為3ul，ASODN的濃度為10nmol/L對細胞存活率影響小(80.4％)，同時細胞的轉染率可高達70.8％，為最理想轉染條件。
　　3、在6h、12h、24h、48h四個不同時間點與空白對照組相比，陰性對照組

10、、T組、T+A組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與陰性對照組相比，T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;與陰性對照組相比，T+A組上清液α-SMA的濃度增加不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與T+A組相比，T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;T組與T+M組上清液α-SMA的濃度之間的差異不

11、明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。NF-κB p65mRNA出現在364bp處。6h、12h、24h、48h四個不同時間點與空白對照組相比，陰性對照組、T組、T+A組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01);與陰性對照組相比，T組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;與陰性對照組相比，T+A組NF-κB p65mRNA的含量增加不明

12、顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;與T+A組相比，T組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;T組與T+M組NF-κB p65mRNA的含量之間的差異不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　4、眼前節(jié)炎癥反應均在一周內消失，組間無統(tǒng)計學差異。術后1周左右，A、B組開始出現后囊膜混濁，隨時間延長而逐漸加重，C、D組后囊混濁發(fā)生時間均遲于A、B組，混濁程度也較A、B組為輕，

13、差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。C、D組之間差異無統(tǒng)計學意義。HE染色后觀察到A、B組后囊表面可見多層成纖維細胞生長，細胞排列較為緊密，囊袋周邊部皮質增生，同時可見明顯纖維素樣物質沉積，C、D組后囊表面相對干凈，僅有少量細胞增殖，細胞排列較為疏松。A、B組后囊膜α-SMA的表達量較C、D組明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義;A組和B組之間，C組和D組之間差異不明顯，無統(tǒng)計學意義。RT-PCR分析結果發(fā)現A、B組NF-κB p65mRN

14、A的表達量較C、D組明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義;A組和B組之間，C組和D組之間差異不明顯，無統(tǒng)計學意義。
　　結論:1、TGF-β2可促進晶狀體上皮細胞的移行，同時反應細胞間質轉分化的α-SMA蛋白的表達增加，應用TGF-β2刺激體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞可成功建立后發(fā)障的細胞模型。
　　2、HiPerFect的劑量為3ul，ASODN的濃度為10nmol/L對細胞存活率影響小(80.4％)，同時細胞的轉染率可高達70.8