轉(zhuǎn)化生長因子β-,2-誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機(jī)制研究.pdf

1、白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)的主要致盲原因，目前尚沒有有效的藥物治療手段可以完全阻止或者延緩其進(jìn)展，通過手術(shù)摘除白內(nèi)障是最主要的治療方法。早期臨床資料顯示，約有41％的白內(nèi)障患者術(shù)后會出現(xiàn)后發(fā)性白內(nèi)障(after cataract，又稱后囊膜混濁，posterior capsular opacification，PCO)。隨著手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)和人工晶狀體的改良，PCO的發(fā)生率有所下降，但目前仍約有20％～25％的術(shù)后患者發(fā)生PCO。PCO是現(xiàn)代白內(nèi)

2、障摘除術(shù)后的主要并發(fā)癥，也是影響術(shù)后視力的主要原因，在一定程度上影響了手術(shù)治療的效果[4]。發(fā)生PCO和需要行二次激光手術(shù)的患者主要是年輕人，尤其是兒童，而且激光手術(shù)還具有一定的風(fēng)險(xiǎn)(如視網(wǎng)膜脫離，黃斑囊樣水腫等)。因此，明確PCO的發(fā)病機(jī)理，從而尋求更為安全有效的防治方法是非常重要的。許多因素對后囊混濁的發(fā)生有影響，包括復(fù)雜的、有創(chuàng)的手術(shù)，殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)及皮質(zhì)，血—房水屏障

3、破壞釋放的炎癥介質(zhì)，術(shù)中植入的人工晶狀體的材料、設(shè)計(jì)及植入的位置等。目前對PCO發(fā)生機(jī)制的研究認(rèn)為，術(shù)后殘留的LECs增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是引起PCO的主要原因[7]。晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是指晶狀體上皮細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，出現(xiàn)類肌纖維母細(xì)胞樣的特征，以上皮細(xì)胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲

4、得為主要特征，是前囊膜下白內(nèi)障(anterior subcapsular cataract，ASC)和PCO的主要病理改變。迄今為止，尚未完全明確刺激晶狀體上皮細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)分化發(fā)生以及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的信號因子，但在離體后發(fā)障模型中的研究已證實(shí)多種調(diào)控因素參與了PCO的發(fā)生過程，包括轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纖維生長因子(fibroblast growth factor，

5、FGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等。其中，TGF-β在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用。 第一部分 轉(zhuǎn)化生長因子β2對人晶狀體上皮細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用 [研究目的] 研究轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)對人晶狀體上皮細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial

6、mesenchymal transition，EMT)的作用，建立后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsular opacification，PCO)的離體研究模型，為全面明確TGF-β2對晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。 [研究方法] 體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE B-3，用不同濃度的TGF-β2處理后，分別采用MTT法測定其對細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用PI細(xì)胞周期染色分析檢測細(xì)胞周期的改變；應(yīng)用共聚焦

7、顯微鏡、RT-PCR法和免疫印跡法觀察和分析晶狀體上皮細(xì)胞中縫隙連接蛋白(connexin43，CX43)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、結(jié)蛋白(desmin)和整合素β1(integrinβ1)等細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)基因和蛋白的變化。 [研究結(jié)果] TGF-β2是晶狀體上皮細(xì)胞重要的促轉(zhuǎn)分化生長因子。TGF-β2對晶狀體上皮細(xì)胞增殖起明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)時(shí)間和濃度的依賴性，當(dāng)濃度為100 pg/ml時(shí)，這種

8、抑制作用達(dá)到了平臺期。TGF-β2刺激后S期的晶狀體上皮細(xì)胞數(shù)量明顯降低，而G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加。TGF-β2誘導(dǎo)后的細(xì)胞由單層立方形變?yōu)殚L梭形，呈纖維細(xì)胞樣形態(tài)。TGF-β2不僅能夠顯著地下調(diào)晶狀體上皮細(xì)胞特征基因connexin43的表達(dá)，而且能夠促使細(xì)胞外間質(zhì)成分fibronectin、desmin和integrinβ1表達(dá)的增多。 [研究結(jié)論] TGF-β2能夠明顯抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖，限制了細(xì)胞周期的正常

9、進(jìn)程，使得細(xì)胞處于異常增殖的狀態(tài)。TGF-β2能夠誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞上皮特征逐漸喪失，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，促使細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，成功構(gòu)建后發(fā)性白內(nèi)障的離體研究模型。 第二部分 PI3K/Akt通路參與轉(zhuǎn)化生長因子β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程 [研究目的] 在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)，用TGF-β2處理晶狀體上皮細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，大部分細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，而

10、這種現(xiàn)象與PCO的形成密切相關(guān)，明確其調(diào)控機(jī)制有助于維持晶狀體上皮細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)與功能。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路在增殖、分化、新陳代謝和凋亡等細(xì)胞活動(dòng)過程中起著重要作用。因此，本部分的研究目的是研究MAPK和PI3K/Akt信號通路是否參與TGF-β2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程及其相關(guān)的作用機(jī)制，進(jìn)一步分析和闡明TGF-β2促進(jìn)PCO形成的機(jī)理。 [研究方法] 培養(yǎng)

11、的人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE B-3，用100 pg/ml的TGF-β2處理后，收集處理后的細(xì)胞。應(yīng)用免疫印跡法檢測TGF-β2對晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)磷酸化和總p38MAPK、ERK1/2及Akt水平的變化。加用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路，分別采用共聚焦顯微鏡和免疫印跡法觀察和分析connexin43、fibronectin、desmin和integrinβ1等細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。 [研

12、究結(jié)果] TGF-β2刺激后晶狀體上皮細(xì)胞ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平稍有增加，但與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TGF-β2可以促使Akt磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，激活晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt通路。加用PI3K特異性抑制劑LY294002干預(yù)后，connexin43的表達(dá)則較單用TGF-β2組明顯升高，兩者相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，desmin蛋白的表達(dá)較單用TGF-β2組減少，但兩組

13、相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TGF-β2誘導(dǎo)的fibronectin和integrinβ1表達(dá)的上調(diào)也可被LY294002有效地抑制。 [研究結(jié)論] TGF-β2能夠激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與了TGF-β2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程。阻斷PI3K/Akt信號通路可有效地抑制TGF-β2誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化進(jìn)程，從而抑制TGF-β2參與的后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生。 本課題從研究TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮

14、細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用機(jī)制入手，分析和探討了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt等與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)信號通路在TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2對晶狀體上皮細(xì)胞增殖起明顯的抑制作用，限制了細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，晶狀體上皮細(xì)胞的特性逐漸喪失，逐漸獲得了間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)，細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，成功地構(gòu)建后發(fā)性白內(nèi)障的離體研究模型。我們還發(fā)現(xiàn)，TGF-β2能夠