臨床觀察無(wú)髓性損傷的慢性頸脊髓壓迫及補(bǔ)腎活血方對(duì)其大鼠模型的干預(yù)機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　本課題旨在觀察無(wú)髓性損傷的慢性頸脊髓壓迫人群的頸肩部疼痛、頸椎活動(dòng)受限、頸椎不穩(wěn)、頸脊髓受壓比例、頸椎JOA評(píng)分，探究該類(lèi)人群上述臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，分析可能影響無(wú)髓性損傷的慢性頸脊髓壓迫人群預(yù)后的危險(xiǎn)因素。改善該類(lèi)人群的治療效果。
　　建立并初步驗(yàn)證無(wú)髓性損傷的慢性頸脊髓壓迫大鼠模型?；贜F-kappa B信號(hào)通路，觀察頸脊髓在慢性輕度壓迫下是否存在炎性反應(yīng)，并以補(bǔ)腎活血方干預(yù)這種炎性反應(yīng)，為進(jìn)一步研究慢性頸脊髓壓

2、迫病機(jī)及治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.臨床觀察
　　收集2013年5月-2014年10月在廣東省中醫(yī)院門(mén)診符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者85例，完成隨訪68例，末次隨訪為2017年2月。根據(jù)頸椎JOA評(píng)分在納入時(shí)和末次隨訪之間的差值，將患者分為（0-1分）低分組和（≥2分）高分組。觀察入組時(shí)核磁影像矢狀面脊髓壓迫比例、頸肩或上臂部疼痛部位（頸后部、枕部、肩部、肩胛區(qū)內(nèi)側(cè)緣、上臂）、頸肩部疼痛性質(zhì)（酸痛、脹痛、刺痛）、疼痛

3、程度、肌肉緊張感、頸椎活動(dòng)受限、頸椎不穩(wěn)等分布情況是否存在組間差別。
　　2.實(shí)驗(yàn)室研究:
　　無(wú)髓性損傷的慢性頸脊髓壓迫大鼠模型驗(yàn)證研究方面，將30只300g-350gSprague Dawley(SD)雄性大鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組（即假手術(shù)組）和模型組，觀察大鼠行為學(xué)評(píng)分（Basso Beattie Bresnahan scores，BBB評(píng)分）以了解大鼠神經(jīng)功能并剔除神經(jīng)功能受損大鼠(BBB評(píng)分＜19分，滿分21分)。

4、蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察脊髓形狀結(jié)構(gòu)變化。造模1周和1月時(shí)用核磁共振明確壓迫部位、壓迫程度及局部是否存在炎性病變，造模后1月取材。
　　炎癥機(jī)制探討研究，將SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（假手術(shù)）和模型組，每組20只。造模后1月取材。
　　補(bǔ)腎活血方干預(yù)和NF-kappa B信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥研究方面，將大鼠分為藥物組（補(bǔ)腎活血方灌胃）、抑制劑組(吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)腹腔注射）、藥物+抑制劑組（補(bǔ)腎活血方灌胃

5、+ PDTC腹腔注射）、模型組，每組20只，中藥（補(bǔ)腎活血方:丹參15g，淫羊藿15g，仙茅15g，附子10g）于造模后第二天給予，PDTC造模前4小時(shí)給予，隨后都每日給予，1月后取材。
　　造模1月后取出受壓脊髓，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)檢測(cè)脊髓中p65、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)量，蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot，WB)檢測(cè)磷酸化-p65(pp65

6、)、TNF-α蛋白表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)量，免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞（Neun標(biāo)記）、活化小膠質(zhì)細(xì)胞（CD68標(biāo)記）、NF-kappa B活化細(xì)胞(p65標(biāo)記)并且計(jì)數(shù)。HE染色切片觀察脊髓神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。持續(xù)評(píng)估（BBB評(píng)分）大鼠神經(jīng)功能并髓性損傷大鼠（＜19分）。中藥復(fù)方指紋圖譜及色譜分析補(bǔ)腎活血方的主要成分。
　　結(jié)果:
　

7、　臨床觀察結(jié)果表明高分組患者中刺痛及頸椎不穩(wěn)的出現(xiàn)頻率較低分組更高，而低分組中伴脹痛的患者更多。(P＜0.05)頸椎不穩(wěn)可能與頸椎JOA評(píng)分下降幅度有關(guān)（-0.264），(P＜0.05)兩組間其他指標(biāo)在兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　與對(duì)照組相比，慢性頸脊髓輕度受壓大鼠神經(jīng)功能BBB評(píng)分在造模后1月內(nèi)沒(méi)有差異。(P＞0.05)造模后1周和1月時(shí)，核磁共振證明模型鼠的頸脊髓存在輕度壓迫，脊髓周?chē)鷽](méi)有水腫信號(hào)，排除周?chē)M織炎性水腫波及脊髓

8、的情況，植入物位置固定，大小相似。造模后1周和1月時(shí)，HE染色表明模型鼠的頸脊髓受到輕度壓迫，但兩組脊髓內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分布均勻，胞體飽滿，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)界限分明。提示造模后1月內(nèi)，模型鼠的慢性受壓脊髓沒(méi)有明顯器質(zhì)性損傷。
　　炎癥機(jī)制探討研究方面，模型組與對(duì)照組相比，p65、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)量在造模1月后均有升高。(P＜0.05)蛋白免疫印跡法提示在造模后1月時(shí)，模型組磷酸化p65和TNF-α的

9、蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組。(P＜0.05)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組活化小膠質(zhì)細(xì)胞和NF-kappa B通路活化的細(xì)胞數(shù)量造模后1月時(shí)均高于對(duì)照組，(P＜0.05)而神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有差異。(P＞0.05)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法結(jié)果顯示模型組大鼠脊髓內(nèi)IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)量在1月時(shí)升高。(P＜0.05)造模后1月內(nèi)BBB評(píng)分提示兩組大鼠的神經(jīng)功能無(wú)明顯差別。(P＞0.05)
　　補(bǔ)腎活血方干預(yù)及NF-kappa B信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥研

10、究方面，藥物組、抑制劑組、藥物+抑制劑組與模型組相比，p65 mRNA表達(dá)量均有降低。(P＜0.05)此外，藥物+抑制劑組p65 mRNA表達(dá)低于藥物組。(P＜0.05)除IL-6的抑制劑組和模型組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，(P＞0.05) IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)量各干預(yù)組均較模型組具有降低，(P＜0.05)藥物+抑制劑組的TNF-α mRNA表達(dá)量低于藥物組和抑制劑組。(P＜0.05) Western Blot表明

11、藥物+抑制劑組的磷酸化-p65(pp65)表達(dá)低于其他各組，(P＜0.05)抑制劑組低于模型組。(P＜0.05)模型組TNF-α表達(dá)高于其他各組，藥物組和抑制劑組的TNF-α表達(dá)高于藥物+抑制劑組(P＜0.05)。IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物組、抑制劑組、藥物+抑制劑組的活化小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于模型組，(P＜0.05)抑制劑組高于藥物+抑制劑組。(P＜0.01)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)在各組之間沒(méi)有差異。(P＞0.05)各組p65陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量均低于模型組，

12、(P＜0.05)藥物+抑制劑組低于抑制劑組和藥物組。ELISA檢測(cè)表明除了抑制劑與模型組之間的IL-6蛋白表達(dá)差異不明顯外，模型組的IL-6和IL-1β高于其他各組，藥物組和抑制劑組的IL-6和IL-1β均高于藥物+抑制劑組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.頸肩及上臂刺痛來(lái)就診，或存在頸椎不穩(wěn)的無(wú)髓性損傷的慢性頸脊髓壓迫患者頸椎JOA評(píng)分中遠(yuǎn)期下降的幅度可能更大，而頸脊髓壓迫比例和就診時(shí)疼痛程度與頸椎JOA評(píng)分下降的幅