脂肪干細胞神經(jīng)分化及對慢性壓迫性脊髓損傷修復的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　慢性壓迫性脊髓損傷是脊髓長期受到漸進行壓迫而出現(xiàn)的一類臨床多發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性損傷性病變，多見于脊柱退行性疾病，如頸椎病、椎間盤突出癥、椎管狹窄癥和后縱韌帶骨化癥等。隨著人類平均壽命的延長及生活和工作方式的改變，該疾病的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病人群年輕化。脊髓慢性持續(xù)性受壓產(chǎn)生的各種病理生理改變，導致受壓部位以下運動、感覺和（或）自主神經(jīng)功能不可逆性障礙，甚至永久性的殘疾，包括癱瘓、感覺喪失、神經(jīng)性疼痛和直腸膀

2、胱功能障礙等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和社會功能，給患者及其家庭帶來巨大的經(jīng)濟損失和心理生理負擔。目前，針對慢性壓迫性脊髓損傷的治療開展了廣泛的臨床治療研究，主要包括持續(xù)壓迫的手術(shù)減壓、不穩(wěn)定病變的融合穩(wěn)定、藥物治療（如激素沖擊治療、清除自由基和抑制炎癥反應等）、繼發(fā)癥和并發(fā)癥的管理，以及后續(xù)的康復治療等。上述治療方案雖然不同程度緩解脊髓損傷的病理改變，延緩了慢性脊髓損傷患者整體結(jié)局，但對于嚴重的脊髓慢性損傷患者(AISA分級為A、B和C

3、級)，上述方案所取得的療效相當有限，僅靠解除壓迫、藥物治療及機體自身的能力無法完全修復脊髓不可逆性的損傷和恢復神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。因此，尋求有效修復脊髓損傷的治療方法仍然是困擾臨床醫(yī)生的難題。
　　近年來，干細胞移植為慢性脊髓損傷的治療帶來新的思路，對于受壓脊髓局部病理生理環(huán)境改善和患者神經(jīng)功能恢復具有很大的潛力，是目前非常有前景的治療策略。脂肪干細胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中

4、分離得到的一種具有穩(wěn)定增殖和多向分化潛能的成體干細胞(Adult stem cells，ASCs)。脂肪儲存是可補充的、豐富的、可以大量獲取并對病人造成最小不適，吸脂手術(shù)與骨髓抽吸相比，脂肪干細胞分離創(chuàng)傷更小，更容易讓患者接受。吸脂及手術(shù)區(qū)域部分脂肪組織通常被認為是醫(yī)學廢物最后丟棄，這是一個很好的自體ADSCs來源，逐漸成為再生醫(yī)學和組織工程研究熱點之一。研究表明，脂肪干細胞在特定的誘導條件下，具有分化成不同胚層來源細胞的潛能，如中胚層

5、來源的成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，外胚層來源的神經(jīng)細胞、表皮細胞，內(nèi)胚層來源的肝細胞、內(nèi)皮細胞、分泌胰島素的β樣細胞等。Safford等在2002年首次在含有丙戊酸、丁基羥基茴香醚、胰島素、氫化可的松的培養(yǎng)基中，誘導第4-5代的脂肪干細胞向神經(jīng)元形態(tài)轉(zhuǎn)變，并表達神經(jīng)表型GFAP、Nestin和NeuN。最近研究表明脂肪干細胞在特定誘導條件下能夠形成神經(jīng)細胞譜系，因此構(gòu)建定向誘導脂肪干細胞形成神經(jīng)細胞譜系的培養(yǎng)體系對于慢性脊髓損傷的治療

6、具有非常重要的意義和潛在的臨床應用價值。本研究的目的:分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠ADSCs，并通過成骨和成脂誘導檢測其多能性;采用小分子化合物Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、維甲酸(Retinoic acid，RA)和丙戊酸鈉(Sodium Valproate，VPA)時序性調(diào)控ADSCs神經(jīng)分化的信號通路，建立誘導ADSCs形成神經(jīng)祖細胞(Neural progenitor cells，NPCs)的平面培養(yǎng)體

7、系，并進一步誘導其形成神經(jīng)元樣細胞;建立慢性壓迫性脊髓損傷大鼠模型，并通過神經(jīng)功能行為學評分和運動誘發(fā)電位檢測評估該模型;Ad-GFP腺病毒標記的ADSCs和NPCs損傷部位原位移植，探究ADSCs及其分化的NPCs對慢性壓迫性脊髓損傷修復以及在體神經(jīng)分化。
　　研究方法：
　　(1)從大鼠附睪旁和腹股溝脂肪組織中利用酶消法分離ADSCs，體外擴增培養(yǎng)ADSCs，細胞流式技術(shù)鑒定ADSCs的免疫表型CD29、CD90、CD3

8、4和CD11b;并使用成骨誘導培養(yǎng)基（HG-DMEM培養(yǎng)基中添加10％FBS、0.1μM地塞米松、0.5μM抗壞血酸和10mMβ-甘油磷酸鈉）和成脂誘導培養(yǎng)基（HG-DMEM培養(yǎng)基中添加10％FBS、0.5mM IBMX、0.2mM吲哚美辛、0.1μM地塞米松和10μM胰島素）誘導ADSCs成骨和成脂分化，誘導21天后分別行茜素紅染色和油紅O染色，測定ADSCs的多能性。
　　(2)使用小分子化合物Dorsomorphin、CHI

9、R99021、SB431542、維甲酸(Retinoicacid，RA)和丙戊酸(Valproic acid，VPA)干預ADSCs神經(jīng)分化的信號通路，模擬神經(jīng)發(fā)育過程，構(gòu)建階段性誘導ADSCs階段性形成神經(jīng)細胞譜系的培養(yǎng)體系。ADSCs在第一誘導階段完全培養(yǎng)基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、2μMDorsomorphin、3μM CHIR99021和2μM SB431542）中培養(yǎng)，采用細胞免疫熒光、western bl

10、ot和RT-PCR分別檢測DMSO對照組和誘導組各誘導時間段(誘導12h、24h、3d、3d和6d)神經(jīng)祖細胞(Neural progenitor cells，NPCs)標志物Pax6和Sox1蛋白和mRNA的表達。隨后，第一誘導階段形成的NPCs在第二誘導階段完全培養(yǎng)基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、2μM Dorsomorphin、1μMCHIR99021、2μM SB431542、0.1μM RA和0.5μM VPA

11、）中培養(yǎng)6天，采用細胞免疫熒光、western blot和RT-PCR檢測對照組和誘導組NeuroD1、ChAT蛋白和mRNA的表達。最后，在第二誘導階段形成的運動神經(jīng)元前體細胞(Motor neuronprecursor cells，MNPs)在第三誘導階段完全培養(yǎng)基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、0.5μμM RA和0.5μM VPA）培養(yǎng)6天，采用細胞免疫熒光、western blot和RT-PCR檢測對照組和誘導組

12、ChAT、βⅢ-tubulin的表達。
　　(3)隨機將50只SD大鼠（雄性，180±20g）分為正常對照組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)和慢性壓迫組(n=30)。改進螺絲釘壓迫建模方法，設(shè)計一種簡便和易于操作的胸椎后路鈦金屬壓迫裝置，手術(shù)將壓迫裝置植入大鼠背部，使鈦壓迫墊片與T10段脊髓接觸。慢性壓迫組于術(shù)后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w將鈦螺絲擰入0.2mm，造成對脊髓的慢性持續(xù)性壓迫。假手術(shù)組只植入壓迫裝置，

13、不擰入鈦螺絲，其余與壓迫組一致。正常對照組不進行手術(shù)操作，其余與假手術(shù)一致。分別于術(shù)前、術(shù)后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w擰入鈦螺絲前行BBB評分。各組大鼠在術(shù)前和術(shù)后1w、2w、4w、6w和8w行經(jīng)顱電刺激運動誘發(fā)電位(Motor evoked potentials，MEP)檢測，計算MEP潛伏期和波幅。造模后4w和8w各組大鼠隨機選取5只，取受壓脊髓行病理學染色和βⅢ-tubulin免疫組化染色觀察脊髓病理變

14、化。
　　(4)采用1×108PFU/ml的Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs和NPCs，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后24h，細胞計數(shù)，并用DMEM/F12重懸細胞，濃度為1×105/5ul。在慢性壓迫性脊髓損傷大鼠模型穩(wěn)定建立后8w，研究ADSCs和NPCs對慢性壓迫性脊髓損傷的修復效應。將20只慢性壓迫性脊髓損傷大鼠隨機分為4組，壓迫對照組(n=5)大鼠不給于手術(shù)減壓和細胞移植;減壓+DMEM組(n=5)行手術(shù)減壓治療，并在損傷部位注射5ul D

15、MEM/F12作為對照;減壓+ADSCs組(n=5)行手術(shù)減壓和損傷部位注射ADSCs(1×105/5ul);減壓+NPCs組(n=5)行手術(shù)減壓和損傷部位注射NPCs(1×105/5ul)。分別在細胞移植前和細胞移植后24h、1w、2w、4w對各組大鼠行BBB評分，在移植后2w和4w行MEP檢測，評估神經(jīng)功能恢復情況。細胞移植后后4w各組大鼠脊髓組織取材，行GFP和βⅢ-tubulin免疫熒光染色，觀察各組大鼠神經(jīng)元存活和脊髓修復情況

16、，探究移植細胞的在體神經(jīng)分化。
　　研究結(jié)果：
　　(1)原代ADSCs在分離后培養(yǎng)的第9天細胞融合約90％左右，細胞呈成纖維細胞樣梭形、放射狀排列。傳代后3-5天細胞可增殖至90％左右。細胞流式分析ADSCs免疫表型結(jié)果:第3代ADSCs的CD29陽性率98.3％、CD90陽性率98.4％，而CD34陽性率為0.79％、CD11b陽性率為1.08％。ADSCs分別在成骨和成脂分化培養(yǎng)基中誘導21天后，成骨分化細胞可見典形的

17、礦化結(jié)節(jié)形成，并且被茜素紅染成橘紅色;成脂分化細胞油紅O染色顯示脂滴被染成大小不等的圓形，聚集在細胞邊緣。
　　(2)使用Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、RA和VPA階段性誘導ADSCs形成神經(jīng)細胞譜系，第一誘導階段培養(yǎng)2d、3d和6d，western blot和RT-PCR結(jié)果表明神經(jīng)祖細胞標志物Sox1和Pax6蛋白和mRNA表達量顯著升高（與DMSO組相比，P＜0.01），并且在第3天達到最高

18、，細胞免疫熒光顯示在誘導的第3天，Sox1和Pax6陽性細胞比例大于90％。在第二誘導階段，NPCs誘導6天后，westernblot和RT-PCR結(jié)果表明早期神經(jīng)元標志物NeuroD1和膽堿能神經(jīng)元標志物ChAT蛋白和mRNA的表達量顯著升高（與對照組，P＜0.01），細胞免疫熒光顯示NeuroD1和ChAT陽性細胞比例大于90％。在第三誘導階段，MNPs誘導6天后，神經(jīng)元標志物βⅢ-tubulin和ChAT的表達量顯著增加，細胞免疫

19、熒光顯示細胞向兩極形成長的突起，形態(tài)與運動神經(jīng)元相似。
　　(3)在慢性壓迫性脊髓損傷建模后1w、2w、3w、4w、5w、6w和7w，BBB評分持續(xù)性下降（和假手術(shù)相比，P＜0.01），造模后7周以后BBB評分呈穩(wěn)定狀態(tài)。經(jīng)顱電刺激運動誘發(fā)電位檢測表明:MEP潛伏期逐漸延長，造模2w后潛伏期與假手術(shù)存在差異(P＜0.05); MEP波幅逐漸減低，造模4周后與假手術(shù)組存在差異(P＜0.05)。病理和免疫組化染色結(jié)果表明:模型組的脊髓

20、呈慢性損傷改變，隨壓迫時間延長，脊髓前角βⅢ-tubulin陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（和假手術(shù)相比，P＜0.01）。
　　(4)Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs和NPCs，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24h后轉(zhuǎn)染率達到大于80％。細胞移植后BBB評分結(jié)果顯示:與壓迫對照組相比，減壓+DMEM組神經(jīng)功能行為學無明顯改善(P＞0.05);減壓+DMEM相比，減壓+ADSCs組在細胞移植后2周神經(jīng)功能行為學出現(xiàn)改善(P＜0.05)，在移植后4周明顯改善(P＜

21、0.01)，而減壓+NPCs組在移植后2周神經(jīng)功能行為學出現(xiàn)明顯改善(P＜0.01)。，減壓+ADSCs組(13.25±0.50)和減壓+NPCs組(14.25±0.96)在移植后4周存在差異(P＜0.05)。經(jīng)顱電刺激運動誘發(fā)電位結(jié)果顯示:和壓迫對照組相比，減壓+DMEM組和減壓+ADSCs組MEP潛伏期在減壓術(shù)后4周改善(P＜0.05)，而減壓+NPCs組MEP潛伏期明顯改善(P＜0.01)。減壓+ADSCs組和減壓+NPCs組無明

22、顯差異(P＞0.05)。MEP波幅變異大，不推薦作為評價神經(jīng)功能恢復的指標。組織免疫熒光顯示:壓迫組脊髓前角βⅢ-tubulin陽性神經(jīng)元數(shù)量很少，神經(jīng)纖維排列紊亂，脊髓空洞明顯。與壓迫組相比，減壓+DMEM組和減壓+ADSCs組脊髓病理改變有改善，βⅢ-tubulin陽性神經(jīng)元數(shù)量存在差異(P＜0.05)。與減壓+DMEM組相比，減壓+NPCs組在細胞移植后4周，脊髓病理改變明顯改善，脊髓空洞被GFP陽性細胞填充，βⅢ-tubulin

23、陽性神經(jīng)元數(shù)量增加(P＜0.05)。減壓+ADSCs組和減壓+NPCs組都未檢測到GFP/βⅢ-tubulin雙陽性的細胞，兩組脊髓前角都存在較多GFP陽性細胞，且數(shù)量無差異(P＞0.05)。但減壓+NPCs組GFP陽性細胞體積較大，形態(tài)呈雙極狀。
　　研究結(jié)論：
　　(1)從大鼠脂肪中提取ADSCs，具有成體干細胞免疫表現(xiàn)，并能夠在體外穩(wěn)定增殖，并有成骨和成脂分化的潛能。
　　(2)小分子化合物Dorsomorphi

24、n、CHIR99021、SB431542、RA和VPA調(diào)控脂肪干細胞神經(jīng)分化的多條信號通路，模擬神經(jīng)發(fā)育過程，階段性誘導ADSCs向神經(jīng)細胞譜系轉(zhuǎn)分化，在第一誘導階段培養(yǎng)3天后ADSCs形成Pax6和Sox1陽性的神經(jīng)祖細胞(Neural progenitor cells，NPCs)，在第二誘導階段形成NeuroD1和ChAT陽性的運動神經(jīng)元前體細胞(Motor neuron precursor cells，MNPs)，分化比率大于90

25、％。在第三誘導階段培養(yǎng)6天后，形成ChAT和βⅢ-tubulin陽性的運動神經(jīng)元樣細胞，但還需細胞膜片鉗檢測是否具有神經(jīng)元膜電位特性。
　　(3)改進螺絲釘壓迫法，設(shè)計慢性壓迫裝置，建立慢性壓迫性脊髓損傷大鼠模型，并通過神經(jīng)功能行為學評分和經(jīng)顱電刺激運動誘發(fā)電位檢測表明該模型符合慢性壓迫性脊髓損傷特點。
　　(4)減壓手術(shù)聯(lián)合ADSCs及其誘導形成的NPCs的移植，相比單純減壓手術(shù)，能夠更好地改善慢性壓迫性脊髓損傷大鼠神經(jīng)功