亞硝酸鹽暴露對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶及突觸發(fā)育的影響.pdf

1、亞硝酸鹽，一類亞硝酸無機(jī)化合物的總稱，以亞硝酸鈉為主。機(jī)體內(nèi)硝酸鹽在口腔和胃內(nèi)細(xì)菌作用下也轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。亞硝酸鈉為白色顆?；蚍勰睿兹苡谒?，并在造紙業(yè)、建筑業(yè)中廣泛使用，食品中也允許作為添加劑限量使用。人體攝入0.3～0.5g的亞硝酸鹽就可引起中毒甚至死亡，機(jī)體長期攝入亞硝酸鹽主要會(huì)引起高鐵血紅蛋白血癥、上消化道腫瘤、先天畸形等結(jié)局，而亞硝酸鹽暴露對(duì)中樞神經(jīng)系的研究較少，尤其是對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響更是少見。還有資料表明，硝酸鹽和亞硝酸鹽

2、在機(jī)體內(nèi)的重要代謝產(chǎn)物---亞硝酰胺中甲基及乙基亞硝基脲可以使大鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物子代產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的畸形，我們推測孕期亞硝酸鹽暴露也可能對(duì)子鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸的發(fā)育產(chǎn)生損害，所以本研究分兩部分從突觸出發(fā)觀察亞硝酸鹽暴露下學(xué)習(xí)記憶的改變情況。其中第一部分：對(duì)成年小鼠進(jìn)行亞硝酸鹽暴露后檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶的改變并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討；第二部分：對(duì)孕期小鼠進(jìn)行亞硝酸鹽暴露觀察子鼠視皮質(zhì)區(qū)突觸的發(fā)育情況并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析。通過兩部分研究

3、更加系統(tǒng)地分析亞硝酸鹽暴露對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的改變情況，加強(qiáng)研究的真實(shí)可信性。
　　目的：探討亞硝酸鹽暴露下小鼠學(xué)習(xí)記憶的改變及孕期亞硝酸鹽暴露對(duì)子代突觸發(fā)育的影響。
　　方法：本研究第一部分應(yīng)用6g·L?1亞硝酸鹽溶液對(duì)63只4~6周齡健康雄性C57BL/6J小鼠持續(xù)灌胃3個(gè)月，以建立亞硝酸鹽暴露模型（低劑量組暴露劑量為60mg·kg?1，高劑量組暴露劑量為120mg·kg?1，對(duì)照組采用生理鹽水灌胃）觀察亞硝酸鹽暴露對(duì)小鼠學(xué)

4、習(xí)記憶能力的改變情況，并對(duì)其改變機(jī)制進(jìn)行初步探討；第二部分則選取7~10周齡成年健康C57BL/6J小鼠，雌鼠63只（未生育），雄鼠22只，雌雄小鼠1∶1合籠交配（16：00），次日8∶00檢查陰道栓塞情況。如發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道存在栓子則將該鼠視為已受孕并將該日定為妊娠第1天(embryonic day0，E0)。確定妊娠當(dāng)日分離出雄鼠，妊娠雌鼠單籠照常飼養(yǎng)。從E0開始對(duì)妊娠雌鼠進(jìn)行亞硝酸鹽暴露處理（低劑量組暴露劑量為60 mg·kg?1，高

5、劑量組暴露劑量為120mg·kg?1，對(duì)照組采用生理鹽水灌胃）直至生產(chǎn)，完成孕期亞硝酸鹽暴露模型的建立。模型建立后，分別用 Morris水迷宮檢測行為學(xué)的改變，利用免疫熒光染色觀察突觸素（Synaptophysin）和突觸核蛋白（γ-Synuclein）的改變，并用western blot技術(shù)對(duì)Synaptophysin進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。
　　結(jié)果：第一部分水迷宮實(shí)驗(yàn)中前2天的獲得性實(shí)驗(yàn)中各組小鼠逃逸潛伏期比較長且沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

6、P>0.05）。第3天開始亞硝酸鹽暴露組小鼠逃逸潛伏期延長且與亞硝酸鹽有劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。對(duì)比小鼠第7天運(yùn)動(dòng)軌跡發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠找到平臺(tái)的路程最短，而高劑量組小鼠探尋平臺(tái)路程軌跡明顯延長且復(fù)雜化。在第8天的探查性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠與對(duì)照組相比，模型組小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均減少且與亞硝酸鹽暴露劑量存在依賴關(guān)系(P<0.05)。各組小鼠視皮質(zhì)突觸數(shù)密度(個(gè)/μm2）進(jìn)行測量時(shí)經(jīng)統(tǒng)計(jì)得出，對(duì)照組突觸數(shù)為4.74

7、±0.56/μm2，低劑量組3.20±0.18/μm2，高劑量組1.89±0.28/μm2，突觸核蛋白的改變情況為：對(duì)照組γ-Synuclein數(shù)為1983±65.89/mm2，低劑量組2394±77.39/mm2，高劑量組3733±175.18/mm2，因此模型組中突觸數(shù)量均明顯減少而γ突觸核蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增多且與亞硝酸鹽暴露有劑量依賴關(guān)系（P<0.05），western blot檢測結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與第一部分

8、結(jié)果相似，在免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中，模型組子鼠視皮質(zhì)突觸數(shù)量減少而γ突觸核蛋白表達(dá)增加且與暴露劑量有依賴關(guān)系（P<0.05），利用水迷宮對(duì)各組子鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，從實(shí)驗(yàn)第3天起亞硝酸鹽暴露組的逃逸潛伏期則高于對(duì)照組（P<0.05），低劑量組和高劑量組之間則沒有明顯差異（P>0.05）；在第8天探查性實(shí)驗(yàn)中，各組目標(biāo)象限停留時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示孕期亞硝酸鹽暴露會(huì)降低子鼠的學(xué)習(xí)能力，而對(duì)空間記憶能力的影響不明顯。