Ad-RUNRF2構(gòu)建及對百草枯致大鼠肺損傷炎癥因子表達(dá)的干預(yù).pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建RU486調(diào)控系統(tǒng)介導(dǎo)的重組腺病毒Ad-RUNRF2，并在H460細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，驗證NRF2基因表達(dá)是否可調(diào)控及表達(dá)效率。觀察Ad-RUNRF2腺病毒對百草枯(PQ)所致A549細(xì)胞損傷及對大鼠百草枯中毒性肺損傷的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB-1表達(dá)的干預(yù)作用。
　　 方法：
　　 1．在腺病毒載體的基礎(chǔ)上，引入攜帶RU486（米非司酮）誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)的NRF2基因；用LU

2、C基因及Dsred基因?qū)U486調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行驗證，并通過Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測NRF2的表達(dá)情況。
　　 2．重組腺病毒Ad-RUNRF2成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以EMSA、Real-timePCR觀察在RU486給予后6、12、24、48hNRF2蛋白及基因表達(dá)情況，WesternBlot、ELISA、Real-timePCR檢測不同濃度(0、10-9、10-8、10-7mol/L)RU486(米非司酮)

3、誘導(dǎo)及在PQ暴露的不同時間（PQ暴露前6h、PQ暴露后0、6、12h）用RU486進(jìn)行誘導(dǎo)后，NRF2表達(dá)對百草枯致A549細(xì)胞損傷炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α蛋白、基因表達(dá)。
　　 3．重組腺病毒Ad-RUNRF2轉(zhuǎn)染大鼠肺組織后，以不同劑量RU486誘導(dǎo)(Oug/kg、125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)及不同時間誘導(dǎo)（中毒前誘導(dǎo)、中毒后48h誘導(dǎo)），通過EMSA及Real-timePCR檢測U

4、486誘導(dǎo)后NRF2蛋白及基因的表達(dá)量，并通過ELISA及Real-TimePCR檢測各組大鼠血漿IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1蛋白表達(dá)量及肺組織各指標(biāo)的mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1．LUC和DSred的表達(dá)都隨RU486呈劑量依賴性增加；Ad-RUNRF2腺病毒感染H460細(xì)胞后，通過RT-PCR及WesternBlot結(jié)果顯示NRF2的表達(dá)量隨著RU486劑量的增加而增加，去除RU486后

5、，NRF2的表達(dá)也隨之減弱。NRF2的變化隨時間的變化而變化，其中以12小時表達(dá)量最高(P＜0.05)。
　　 2.NRF2表達(dá)隨著RU486增加而增加，以10-7mol/L時最強，1L-6、TNF-α的表達(dá)與RU486誘導(dǎo)量呈反比，在10-7mol/L時表達(dá)量最低(P＜0.05)，而IL-10的表達(dá)則相反。NRF2表達(dá)在PQ暴露前6h誘導(dǎo)表達(dá)量最高，與對照組及其他時間點表達(dá)有顯著性差異（P＜0.01），有RU486誘導(dǎo)組NRF

6、2表達(dá)與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.01），PQ暴露0、6、12h誘導(dǎo)NRF2表達(dá)量逐漸上升。不同時間點RU486誘導(dǎo)對IL-6、L-10、TNF-α蛋白、基因表達(dá)亦有影響，其中PQ暴露0小時時，效果最佳，與對照組相比有明顯治療效果(P＜0.05)。
　　 3．動物實驗結(jié)果Nrf2基因及蛋白在RU486調(diào)控下，隨著RU486濃度的增加而增加，在無RU486誘導(dǎo)時Ad-RUNRF2腺病毒轉(zhuǎn)染的大鼠肺組織仍有一定數(shù)量的Nrf2

7、基因及蛋白表達(dá)。不同的時間誘導(dǎo)時，與PQ中毒對照組及空白組相比，提前誘導(dǎo)組及治療組基因及蛋白表達(dá)顯著性增加(P＜0.01)，但兩組之間則無顯著性差異（P＞0.05）。RU486誘導(dǎo)組TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB-1表達(dá)與無RU486誘導(dǎo)組有顯著性差異(P＜0.05)，其中250ug/kg劑量RU486誘導(dǎo)時抗炎及促炎表達(dá)更為平衡；誘導(dǎo)時間對炎癥因子的表達(dá)無顯著性影響，但與PQ中毒對照組比有顯著性差異（P＜0.05）。

8、>　　 結(jié)論:
　　 攜帶RU486可調(diào)控式NRF2基因腺病毒構(gòu)建成功，并且在細(xì)胞內(nèi)RU486能夠調(diào)節(jié)NRF2因子的表達(dá)。重組腺病毒Ad-RUNRF2在不同濃度RU486調(diào)節(jié)NRF2表達(dá)，對炎癥因子表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。RU486在PQ中毒時同時誘導(dǎo)，效果最好，認(rèn)為Ad-RUNRF2可以減輕A549細(xì)胞中由百草枯引起的炎癥反應(yīng)。不同濃度RU486誘導(dǎo)對大鼠百草枯急性肺損傷時炎癥因子表達(dá)有顯著干預(yù)作用，而誘導(dǎo)時間對炎癥因子表達(dá)則無明顯