Ad-RUNRF2構建及對百草枯致大鼠肺損傷炎癥因子表達的干預.pdf

1、目的：
　　 構建RU486調(diào)控系統(tǒng)介導的重組腺病毒Ad-RUNRF2，并在H460細胞中進行表達，驗證NRF2基因表達是否可調(diào)控及表達效率。觀察Ad-RUNRF2腺病毒對百草枯(PQ)所致A549細胞損傷及對大鼠百草枯中毒性肺損傷的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB-1表達的干預作用。
　　 方法：
　　 1．在腺病毒載體的基礎上，引入攜帶RU486（米非司酮）誘導調(diào)控系統(tǒng)的NRF2基因；用LU

2、C基因及Dsred基因?qū)U486調(diào)控系統(tǒng)進行驗證，并通過Westernblot和RT-PCR技術檢測NRF2的表達情況。
　　 2．重組腺病毒Ad-RUNRF2成功轉(zhuǎn)染A549細胞，以EMSA、Real-timePCR觀察在RU486給予后6、12、24、48hNRF2蛋白及基因表達情況，WesternBlot、ELISA、Real-timePCR檢測不同濃度(0、10-9、10-8、10-7mol/L)RU486(米非司酮)

3、誘導及在PQ暴露的不同時間（PQ暴露前6h、PQ暴露后0、6、12h）用RU486進行誘導后，NRF2表達對百草枯致A549細胞損傷炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α蛋白、基因表達。
　　 3．重組腺病毒Ad-RUNRF2轉(zhuǎn)染大鼠肺組織后，以不同劑量RU486誘導(Oug/kg、125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)及不同時間誘導（中毒前誘導、中毒后48h誘導），通過EMSA及Real-timePCR檢測U

4、486誘導后NRF2蛋白及基因的表達量，并通過ELISA及Real-TimePCR檢測各組大鼠血漿IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1蛋白表達量及肺組織各指標的mRNA表達情況。
　　 結果:
　　 1．LUC和DSred的表達都隨RU486呈劑量依賴性增加；Ad-RUNRF2腺病毒感染H460細胞后，通過RT-PCR及WesternBlot結果顯示NRF2的表達量隨著RU486劑量的增加而增加，去除RU486后

5、，NRF2的表達也隨之減弱。NRF2的變化隨時間的變化而變化，其中以12小時表達量最高(P＜0.05)。
　　 2.NRF2表達隨著RU486增加而增加，以10-7mol/L時最強，1L-6、TNF-α的表達與RU486誘導量呈反比，在10-7mol/L時表達量最低(P＜0.05)，而IL-10的表達則相反。NRF2表達在PQ暴露前6h誘導表達量最高，與對照組及其他時間點表達有顯著性差異（P＜0.01），有RU486誘導組NRF

6、2表達與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.01），PQ暴露0、6、12h誘導NRF2表達量逐漸上升。不同時間點RU486誘導對IL-6、L-10、TNF-α蛋白、基因表達亦有影響，其中PQ暴露0小時時，效果最佳，與對照組相比有明顯治療效果(P＜0.05)。
　　 3．動物實驗結果Nrf2基因及蛋白在RU486調(diào)控下，隨著RU486濃度的增加而增加，在無RU486誘導時Ad-RUNRF2腺病毒轉(zhuǎn)染的大鼠肺組織仍有一定數(shù)量的Nrf2

7、基因及蛋白表達。不同的時間誘導時，與PQ中毒對照組及空白組相比，提前誘導組及治療組基因及蛋白表達顯著性增加(P＜0.01)，但兩組之間則無顯著性差異（P＞0.05）。RU486誘導組TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB-1表達與無RU486誘導組有顯著性差異(P＜0.05)，其中250ug/kg劑量RU486誘導時抗炎及促炎表達更為平衡；誘導時間對炎癥因子的表達無顯著性影響，但與PQ中毒對照組比有顯著性差異（P＜0.05）。

8、>　　 結論:
　　 攜帶RU486可調(diào)控式NRF2基因腺病毒構建成功，并且在細胞內(nèi)RU486能夠調(diào)節(jié)NRF2因子的表達。重組腺病毒Ad-RUNRF2在不同濃度RU486調(diào)節(jié)NRF2表達，對炎癥因子表達有調(diào)節(jié)作用。RU486在PQ中毒時同時誘導，效果最好，認為Ad-RUNRF2可以減輕A549細胞中由百草枯引起的炎癥反應。不同濃度RU486誘導對大鼠百草枯急性肺損傷時炎癥因子表達有顯著干預作用，而誘導時間對炎癥因子表達則無明顯