PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)百草枯致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 百草枯是一種速效高效觸殺型除草劑，由于其安全而對(duì)環(huán)境無害，在全世界范圍內(nèi)得到廣泛使用。我國作為農(nóng)業(yè)大國，是目前世界生產(chǎn)和使用百草枯最多的國家之一。臨床上許多患者自殺性口服或者誤服百草枯成為百草枯中毒就診的主要原因。由于百草枯的中毒致死劑量較小，而且目前尚無特效解毒藥物，在臨床上病死率極高。由于肺臟中存在著多胺攝取及其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，百草枯結(jié)構(gòu)與其相似，可競爭性抑制聚胺類物質(zhì)的攝取及聚集，故肺臟成為百草枯損傷的主要靶器官。

2、百草枯通過肺泡上皮細(xì)胞和氣管clara細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肺內(nèi)并大量蓄積，通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧自由基以及炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致肺組織炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，引起急性肺組織損傷，臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）在調(diào)節(jié)脂質(zhì)和糖代謝、參與抗氧化、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等方面起關(guān)鍵作用。當(dāng)PPAR-γ與特異性配體相結(jié)合，空間構(gòu)象發(fā)生改變，通過與相應(yīng)靶基因啟動(dòng)子上的PPRE結(jié)合，激活N

3、rf2等靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)抗氧化酶——過氧化氫酶、超氧化物岐化酶(SOD)的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。PPAR-γ還直接與NF-κB、活化蛋白-1等結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄抑制性復(fù)合物，阻止炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究采用PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)處理，研究其對(duì)百草枯中毒致急性肺損傷所產(chǎn)生的生物學(xué)作用，并通過體外實(shí)驗(yàn)研究羅格列酮對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能影響，并分析其內(nèi)在可能的生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法:

4、>　　 1、百草枯中毒致大鼠急性肺損傷動(dòng)物模型的建立及鑒定
　　 采用一次性腹腔注射百草枯（20 mg/kg）建立大鼠中毒模型，在4h、8h、1d、3d、5d時(shí)候在臨床表現(xiàn)、大體形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、肺臟濕/干重測定、HE染色等方面加以觀察研究分析。
　　 2、PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)百草枯中毒致大鼠急性肺損傷保護(hù)作用
　　 采取低劑量羅格列酮（3 mg/kg，RSGL組）和高劑量羅格列酮(10 mg/kg，RSGH組)在腹

5、腔注射百草枯前1h對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)處理，然后按照百草枯20 mg/kg劑量進(jìn)行大鼠染毒，在4h、8h、1d和3d在臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、肺臟濕/干重測定、HE染色、血清酶學(xué)(MDA、SOD)、血清炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α）、免疫組化染色（PPAR-γ，NF-κBp65, Nrf2）和Western-blot（PPAR-γ，NF-κ Bp65, Nrf2，IκBα，pIκBα）等方面加以觀察研究分析。
　　 3、PPAR-

6、γ激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)百草枯染毒的巨噬細(xì)胞RAW264.7功能影響
　　 (1)采用MTT法檢測不同濃度百草枯（1μM、5μM、10μM、50μM、100μM、500μM）對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 (2)采用不同濃度羅格列酮(0.1μM、1μM、10μM、100μM)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞懸液進(jìn)行預(yù)處理，1h后再用百草枯(100μM)進(jìn)行染毒，在24 h后使用MTT方法檢測肺泡巨噬細(xì)胞增殖活性、使用Elisa方

7、法檢測IL-1β和TNF-α濃度、使用Western-blot方法檢測NF-κB、PPAR-γ、 Nrf2蛋白表達(dá)等情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功建立百草枯中毒致大鼠急性肺損傷動(dòng)物模型
　　 一次性腹腔注射百草枯（20 mg/kg）可以建立大鼠急性肺損傷動(dòng)物模型，臨床表現(xiàn)可以出現(xiàn)呼吸困難、進(jìn)食水差等癥狀，肺組織出現(xiàn)充血水腫，肺臟濕/干重比值明顯增加。顯微鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)出血等變化，

8、肺組織損傷指數(shù)明顯增加。百草枯中毒1 d～3d時(shí)候損傷尤為明顯，中毒5d時(shí)部分大鼠發(fā)生死亡。
　　 2、PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮可以保護(hù)由于百草枯中毒所造成的大鼠肺組織損傷
　　 百草枯中毒以后內(nèi)源性PPAR-γ表達(dá)明顯降低，核NF-κ Bp65蛋白表達(dá)明顯增加，Nrf2蛋白表達(dá)增加，血清中抗氧化酶SOD活性下降，促氧化酶MDA水平增加，炎性細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)水平增加。經(jīng)過羅格列酮預(yù)處理后，無論是低劑量

9、（3 mg/kg，RSGL組）還是高劑量(10 mg/kg，RSGH組)均可以減輕百草枯所造成的急性肺損傷，高劑量組(RSGH組)作用更為明顯。羅格列酮可以減輕肺組織水腫，降低肺臟濕/干重比值以及肺損傷指數(shù)，降低血清MDA水平，增加血清SOD活力，降低血清炎性細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)水平，增加PPAR-γ蛋白表達(dá)，增加Nrf2蛋白表達(dá)，使pIκ Bα發(fā)生磷酸化，降低胞漿中IκBα表達(dá)，降低核NF-κBp65蛋白表達(dá)，減輕肺組織

10、損傷。
　　 3、PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮可以抑制百草枯染毒后巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌炎性細(xì)胞因子
　　 百草枯可以呈劑量依賴性抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖活性，刺激炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α濃度的分泌，誘導(dǎo)NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯增加，PPAR-γ蛋白表達(dá)減少，Nrf2蛋白表達(dá)增加。經(jīng)過PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮預(yù)處理后可以呈劑量依賴性恢復(fù)其增殖活性，降低NF-κBp65蛋白表達(dá)，增加Nrf2和

11、PPAR-γ蛋白的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌和表達(dá)炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α。
　　 結(jié)論:
　　 1、經(jīng)過PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮預(yù)處理后，可以明顯減輕百草枯致大鼠急性肺損傷的癥狀，減輕肺組織水腫和降低炎癥反應(yīng)，羅格列酮具有良好的抗炎和抗氧化作用。
　　 2、PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮可能通過與PPAR-γ受體結(jié)合，激活Nrf2和抑制NF-κB發(fā)揮抗氧化抗炎作用，起到保護(hù)肺組織損傷的作用。