Chk1介導的CCNB1高表達在結直腸癌中的作用及機制研究.pdf

1、結直腸癌是嚴重危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在女性惡性腫瘤中高居第二位、男性中高居第三位，僅次于肺癌和乳腺癌。每年全球結直腸癌新發(fā)病例超過136萬，死亡病例約69萬。在我國，其發(fā)病率隨著人民生活水平的提高、飲食結構向高脂高蛋白低纖維素方向變化而逐年上升，結直腸癌已成為我國近30年來發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤。隨著近年來醫(yī)學水平的不斷進步，人們對于結直腸癌的治療水平也有了長足的發(fā)展，目前關于結直腸癌發(fā)生發(fā)展及浸潤、擴散、轉

2、移機制研究方興未艾。
　　結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個極復雜的過程，不僅與環(huán)境、飲食及生活習慣等各種外在因素有關，其內在更是一個多階段、多步驟、多基因參與的復雜過程。盡管在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中有大量的分子事件被發(fā)現(xiàn)，這些分子事件在這一過程中發(fā)揮著至關重要的作用，但這些分子事件在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用尚未完全清楚。
　　細胞周期素B1(CCNB1)是細胞周期蛋白家族中一個重要的成員，是細胞G2/M檢測點有關的重要細胞周期

3、調控因子。它的一個重要角色就是調節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)并與之形成復合體后使底物磷酸化，啟動細胞從G1/S期進入G2/M期，并促進有絲分裂。越來越多的證據(jù)表明CCNB1參與了細胞周期檢測點的控制，它的功能障礙是腫瘤發(fā)生中的早期事件，在人類許多腫瘤中可以觀察到其失調控表達，包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌等。同時，有證據(jù)表明抑制CCNB1的表達可以使乳腺癌細胞對化療更加敏感。此外，研究表明在腫瘤細胞中野生型P53通過SP1轉錄因子抑

4、制CCNB1的轉錄表達。在結直腸癌細胞株HCT116 p53+/+細胞中CCNB1的蛋白水平呈低表達，而在HCT116 p53-/-細胞中呈高表達。這些研究表明CCNB1在腫瘤發(fā)展中潛在的關鍵作用，然而，CCNB1在結直腸癌中的具體功能機制尚未可知。
　　大部分癌癥被認為高度依賴于細胞周期檢查點激酶1(Chk1)的異常表達，并且CCNB1在以前是被作為預測Chk1抑制劑的療效的生物標記物。目前對于CCNB1和Chk1各自在腫瘤中的

5、表達機理及臨床意義的研究較多，但對二者在結直腸癌中是否存在相關性以及二者通過何種途徑共同影響結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展方面的研究仍不清楚。
　　本研究通過檢測CCNB1、Chk1在結直腸癌和正常結直腸組織標本中的表達情況、分析其相關性，并通過體外細胞功能實驗驗證Chk1是CCNB1的正向調控因子，同時結合體內外實驗深入探索CCNB1對結直腸癌細胞生物學行為的影響，探討其發(fā)揮生物學效應的具體作用機制。本研究旨在揭示結直腸癌發(fā)生發(fā)展的新機制

6、，并為探尋結直腸癌防治新策略提供堅實可靠的實驗證據(jù)和理論支持。
　　第一部分 CCNB1在結直腸癌中的表達及功能研究
　　目的:
　　驗證CCNB1在結直腸癌組織中表達升高，明確CCNB1對結直腸癌細胞增殖、周期、凋亡等生物學行為的影響。
　　方法:
　　收集結直腸癌組織和癌旁正常組織標本，采用實時熒光定量PCR(quantitativereal-time RT-PCR，qRT-PCR)法檢測30對結直腸癌

7、組織及癌旁正常組織的CCNB1mRNA和蛋白的表達水平。分別選取P53-wild HCT116、P53-mutant SW480和P53-null HCT116細胞株作為實驗對象，利用細胞轉染技術分別轉染CCNB1特異性siRNA或陰性對照siRNA，并采用MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力、PI單染檢測細胞周期分布、Annexin-Ⅴ聯(lián)合PI法檢測細胞凋亡、western blot檢測CCNB1調控的下游周期蛋白及凋亡蛋白表達。
　

8、　結果:
　　1.CCNB1在結直腸癌組織中的表達較癌旁正常組織顯著升高。
　　2.在結直腸癌細胞株P53-wild HCT116、SW480和P53-null HCT116中，抑制CCNB1的表達均能能抑制腫瘤細胞的增殖，并能通過調節(jié)細胞周期相關分子CDK1/CDC25C促使細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯。
　　3.在P53-wild HCT116細胞中抑制CCNB1表達能夠通過調節(jié)p53/Bax通路促使腫瘤細胞發(fā)生早期

9、凋亡，而在P53-null HCT116細胞中抑制CCNB1表達也能通過非p53途徑促進腫瘤細胞發(fā)生早期凋亡。
　　結論:
　　1.CCNB1在結直腸癌組織中表達顯著升高。
　　2.下調CCNB1的表達可抑制結直腸癌細胞增殖、誘導細胞周期G2/M期阻滯和促進腫瘤細胞凋亡，提示CCNB1在結直腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮致癌作用。
　　第二部分 結直腸癌CCNB1高表達依賴-細胞周期檢查點激酶1(Chk1)的表達
　　

10、目的:
　　確定Chk1是CCNB1的上游調控分子，揭示Chk1在結直腸癌中的作用機制。
　　方法:
　　首先，分別在結直腸癌組織和癌旁正常組織中用qRT-PCR法檢測Chk1 mRNA的表達水平，western blot法檢測Chk1的蛋白表達水平，分析與CCNB1的組織相關性。其次，利用siRNA特異性干擾結直腸癌細胞中Chk1的表達，western blot檢測CCNB1的蛋白表達，MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力

11、，明確Chk1在結直腸癌中的作用和對CCNB1的調控作用。
　　結果:
　　1.Chk1在結直腸癌組織中的表達水平均較癌旁正常組織明顯增高，并與CCNB1表達水平呈顯著正相關。
　　2.干擾結直腸癌細胞Chk1的表達可抑制CCNB1的蛋白水平，細胞增殖能力受阻。
　　結論:
　　Chk1在結直腸癌中靶向調控CCNB1的表達，提示Chk1是CCNB1的上游調控分子。
　　第三部分 慢病毒介導的CCNB1

12、 shRNA對結直腸癌裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究
　　目的:
　　明確持續(xù)抑制CCNB1表達對裸鼠移植瘤生長的調控作用。
　　方法:
　　首先構建含特異性靶向CCNB1基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒表達載體，將慢病毒分別轉導HCT116和SW480細胞株，通過抗生素篩選后得到各自的CCNB1穩(wěn)定低表達細胞株，western blot法檢測CCNB1的表達水平以明確穩(wěn)篩效率。將上述穩(wěn)轉細胞株及相對應的慢病

13、毒空載體轉導的對照組細胞株分別接種于裸鼠皮下，觀察成瘤及移植瘤生長情況，免疫組織化學染色方法檢測移植瘤中CCNB1的表達，western blot檢測移植瘤中與CCNB1的下游分子，包括CDC25C、CDK1、p53和Bax的表達。
　　結果:
　　1.抑制CCNB1的表達可抑制裸鼠移植瘤的生長速度。
　　2.在移植瘤中抑制CCNB1表達能夠抑制CCNB1下游細胞周期相關蛋白CDC25C和CDK1的表達下降，在HCT1