SDHB在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、研究背景與目的:結(jié)直腸癌是世界上第三大常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約120萬(wàn)例，死亡人數(shù)達(dá)60萬(wàn)。在我國(guó)，結(jié)直腸癌位居惡性腫瘤死亡率第四位。近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病和死亡呈明顯上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程。80％以上的結(jié)直腸癌是從腺瘤癌變而來(lái)，而從腺瘤的發(fā)生至癌變的發(fā)生、發(fā)展，主要涉及癌基因、抑癌基因、錯(cuò)配修復(fù)基因等三類(lèi)基因的變化。其中抑癌基因的異常在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其失

2、活或缺失可導(dǎo)致細(xì)胞去調(diào)節(jié)性生長(zhǎng)，克隆性擴(kuò)張。因此，在結(jié)直腸癌病因?qū)W研究中，有必要尋找與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因，探討其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，進(jìn)一步從分子水平闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，為疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　本課題組前期研究采用熒光差異雙向電泳技術(shù)構(gòu)建了不同臨床分期結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase，SDH)是結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中一個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)

3、分子，可能具有潛在的抑癌功能。SDH也稱(chēng)為線(xiàn)粒體復(fù)合物(Ⅱ)，定位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，是由A、B、C、D四個(gè)亞基組成的異源四聚體，分別由相應(yīng)的核基因編碼。SDH是三羧酸循環(huán)和線(xiàn)粒體呼吸鏈的組成部分，其在細(xì)胞能量代謝中起到重要的作用。SDH作為一個(gè)抑癌基因，其基因缺陷或表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎癌、胃腸道間質(zhì)瘤、Leigh綜合征等。前期研究中我們利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了包含103例病例的結(jié)直腸組織芯片中SDH的表達(dá)

4、情況，發(fā)現(xiàn)SDHB蛋白在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)較正常結(jié)直腸粘膜明顯下調(diào)，且SDHB在低分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較中、高分化癌組織明顯減弱。
　　目前對(duì)SDH基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量檢測(cè)SDHB在低分化結(jié)腸癌組織中的表達(dá)以進(jìn)一步證實(shí)SDHB的表達(dá)與結(jié)腸癌分化程度的關(guān)系。為了進(jìn)一步深入研究SDHB基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建了SDHB過(guò)表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系以明確SD

5、HB基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞SW620生物學(xué)行為的影響。同時(shí)研究了SDHB基因?qū)W620細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。此外，我們從SDHB基因突變和啟動(dòng)子甲基化兩個(gè)方面對(duì)SDHB在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　方法:本研究在包含32個(gè)點(diǎn)陣的低分化結(jié)腸癌組織芯片中應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了SDHB蛋白的表達(dá)。而后采用真核表達(dá)載體pIRESneo3構(gòu)建了SDHB基因穩(wěn)定表達(dá)載體pIRES-SDHB，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其導(dǎo)入SW620細(xì)胞

6、，建立了SDHB穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、平板集落形成、裸鼠移植瘤形成試驗(yàn)等明確SDHB對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的作用。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)SDHB對(duì)SW620細(xì)胞周期的影響，同時(shí)采用Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclin D1和PCNA的表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建人全基因組表達(dá)譜芯片探究了SDHB基因過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。此外，提取了40對(duì)結(jié)直腸癌及配對(duì)的癌旁正常結(jié)直腸粘膜組織gD

7、NA，一方面采用PCR擴(kuò)增了SDHB基因各外顯子片段，產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向測(cè)序檢測(cè)各外顯子突變情況;另一方面將gDNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，采用甲基化特異性PCR檢測(cè)SDHB基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:(1) SDHB在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)
　?、倜庖呓M織化學(xué)檢測(cè)SDHB蛋白在結(jié)直腸癌組織芯片中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SDHB在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)較正常結(jié)直腸粘膜明顯下調(diào)，且其在低分化結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較中、高分化明顯減弱。
　　

8、②Western blot檢測(cè)SDHB蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SDHB在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)正常粘膜組織明顯減弱。
　　(2) SDHB基因轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　①細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示轉(zhuǎn)染SDHB基因顯著抑制了SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　?、谄桨寮湫纬稍囼?yàn)顯示轉(zhuǎn)染SDHB基因顯著抑制SW620細(xì)胞的集落形成能力。
　?、勐闶笠浦擦鲂纬蓪?shí)驗(yàn)表明SDHB抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞致瘤性。

9、r>　?、芰魇郊?xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SDHB基因?qū)е耂W620細(xì)胞周期發(fā)生G1-S期阻滯。
　?、軼estern blot及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SDHB下調(diào)SW620細(xì)胞中cyclin D1及PCNA的表達(dá)。
　　(3) SDHB對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
　?、俨捎肐llumina公司的人全基因組表達(dá)譜芯片（Human HT-12 v4）共篩選出受SDHB基因調(diào)控結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中差異表達(dá)的基因共1653個(gè)，

10、其中上調(diào)基因1382個(gè)，下調(diào)基因271個(gè)。
　　②采用real-time PCR驗(yàn)證了部分差異表達(dá)基因，結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明芯片數(shù)據(jù)可靠。
　?、跥O分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞周期及其調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。
　　④KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與p53、MAPK、Toll樣受體、ErbB、Jak-STAT、T細(xì)胞受體、Notch、Wnt、TGF-β、VEGF、細(xì)胞因子

11、相互作用等信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　(4) SDHB在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制
　?、貾CR擴(kuò)增SDHB基因各外顯子片段，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)在40例結(jié)直腸癌和與配對(duì)的正常結(jié)直腸粘膜組織標(biāo)本中SDHB基因第一外顯子第18個(gè)堿基處存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，堿基由C顛換成A，致第6位密碼子由GCC變?yōu)镚CA，兩個(gè)密碼子均編碼丙氨酸，為一同義突變;未發(fā)現(xiàn)致病性突變。結(jié)果提示SDHB基因外顯子突變可能不是單純性結(jié)直腸癌的致病原因。
　?、贛SP

12、法未能在上述40對(duì)組織中檢測(cè)出SDHB基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化，推測(cè)SDHB在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)可能不是由啟動(dòng)子區(qū)甲基化引起的。
　　結(jié)論:(1) SDHB在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)水平與結(jié)直腸癌組織分化程度相關(guān)，在低分化癌組織中表達(dá)較中、高分化癌組織明顯減弱。
　　(2)SDHB可抑制體外SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞G1-S期阻滯;抑制SW620細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的形成。
　　(3) SDHB基因外