構(gòu)建Nt-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架緩釋系統(tǒng)及研究其體外實驗.pdf

1、近年來，為了治療脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)，組織工程學(xué)，通過支架材料復(fù)合種子細(xì)胞，額外添加營養(yǎng)因子，對脊髓再生進(jìn)行重構(gòu)，從而促進(jìn)其功能恢復(fù)。其中支架材料可以提供適宜微環(huán)境和一定的機(jī)械支撐，促使種子細(xì)胞的粘附、生長，在組織工程修復(fù)中具有相當(dāng)重要作用。
　　目前常用的脊髓支架材料，如:透明質(zhì)酸、PLGA絲蛋白-殼聚糖復(fù)合支架材料等。雖然以上材料具有各自獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但是它們不具備脊髓特有結(jié)構(gòu)，如微觀三維網(wǎng)狀

2、結(jié)構(gòu)，因此在脊髓修復(fù)重建中有局限作用。
　　前期研究，脊髓組織被脫細(xì)胞，得到ECM三維空間結(jié)構(gòu)，膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等被保留，即脫細(xì)胞脊髓支架材料。但前期的脊髓脫細(xì)胞方法尚不穩(wěn)定，主要表現(xiàn)在脫細(xì)胞徹底而細(xì)胞外基質(zhì)保留不完整，或者細(xì)胞外基質(zhì)保留完整而脫細(xì)胞不徹底，此外脫細(xì)胞脊髓支架復(fù)合種子細(xì)胞后還遭遇神經(jīng)營養(yǎng)因子匱乏的難題。因此，進(jìn)行一下研究:①脫細(xì)胞方法被優(yōu)化，支架的制備過程被穩(wěn)定化;②并采用化學(xué)交聯(lián)的方法結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)因

3、子-3(NT-3)，使NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架的緩釋系統(tǒng)具有緩釋活性作用;③NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架復(fù)合種子細(xì)胞后具有獨(dú)特的作用，可以促進(jìn)種子細(xì)胞粘附、增殖等。
　　目的:1.脫細(xì)胞方法被優(yōu)化，脊髓ECM結(jié)構(gòu)被保留，細(xì)胞被徹底去除。
　　2.采用碳化二亞胺(EDC)化學(xué)交聯(lián)的作用，將NT-3結(jié)合到脫細(xì)胞脊髓支架上，制備NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架的緩釋系統(tǒng)，分析該緩釋系統(tǒng)NT-3的緩釋性、緩釋NT-3的生物活性。
　

4、　3.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)被復(fù)合NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架上，支架對BMSCs粘附、增殖的影響。
　　方法:1.傳統(tǒng)法和優(yōu)化法，制備脊髓支架，采用肉眼觀察、掃描電鏡、光鏡、凍干、稱重、酶解等技術(shù)對比研究支架的特性。
　　2.ELISA法被用來檢測NT-3緩釋性，緩釋NT-3的生物學(xué)活性被E18孕鼠體內(nèi)胚鼠的背根神經(jīng)節(jié)驗證，NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架整體蛋白分解性被BCA蛋白測定法檢測。
　　3.對BMSC

5、s進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代等操作，得到P3代BMSCs，復(fù)合到脫細(xì)胞脊髓支架和NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架后，共培養(yǎng)4小時后采用DAPI檢測BMSCs在不同支架的粘附性;在不同的時間點(diǎn)，如共培養(yǎng)24小時、48小時后，不同支架對BMSCs增殖的影響被CCK-8檢測。
　　結(jié)果:1.優(yōu)化組制備的支架“優(yōu)”等級為80％，HE評分“優(yōu)”等級的支架經(jīng)過DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡檢測，內(nèi)部結(jié)構(gòu)脫細(xì)胞徹底，評分也為“優(yōu)”等級;電子顯微鏡掃描可見三

6、維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑平均為31.02um，含水率為（228.14±19.39）％，孔隙率為(71.82±2.10)％;在4、8、12、16、20小時不同時間段的抗酶解性為(8.268±1.229)％、(16.16±1.568)％、(23.5±2.252)％、(28.582±2.243)％、(35.904±1.911)％。優(yōu)化組支架脫細(xì)胞徹底，制備效率高，孔徑與傳統(tǒng)組支架相當(dāng)，但是含水率、孔隙率、抗酶解性均優(yōu)于傳統(tǒng)組支架。
　　2.脫細(xì)

7、胞脊髓支架與NT-3通過EDC交聯(lián)，NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架被成功構(gòu)建，采用ELISA法測定NT-3在不同時間段的緩釋量，緩釋性可達(dá)35天，在1、4、7、14、21、28、35天時間段的NT-3緩釋濃度分別為（480.52±69.88）pg/ml、（111.43±5.34）pg/ml、（66.11±17.99）pg/ml、（121.35±7.85）pg/ml、（61.34±9.88）pg/ml、（36.22±16.37）pg/ml、（

8、29.95±12.95）pg/ml;翻倍提高NT-3濃度后，采用背根神經(jīng)節(jié)法驗證緩釋NT-3的生物學(xué)活性，第一天NT-3緩釋液可以促進(jìn)（72.00±8.19）根神經(jīng)突生長，第四天為（32.67±8.14）根，第七天為（10.33±2.52）根，第十四天為(31.67±8.96)根，二十一天為（8.33±3.79）根，二十八天為（5.00±1.00）根，三十五天為（4.67±1.53）根，陰性對照為（9.00±2.00）根，陽性對照為(9

9、3.67±33.23)根。其中低于陰性對照組的是二十八天、三十五天、二十一天結(jié)果;在培養(yǎng)基中，被分解的NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架整體蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定，在1、4、7、14、21、28天的不同時間段內(nèi)緩釋的蛋白濃度均低于0.2ug，證明被加入培養(yǎng)基條件下，NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架可以保留28天。
　　3.3.7×105/ml，40ul大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液被后復(fù)合NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架后，4小時細(xì)胞粘附數(shù)量

10、為（109±5）個，優(yōu)于交聯(lián)支架（46±19）個;濃度為1.0×105/ml，10ul大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液，與不同組支架共培養(yǎng)24小時和48小時后，NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架均有利于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:1.脫細(xì)胞法被成功優(yōu)化，細(xì)胞成分被較徹底地去除，脊髓ECM三維空間結(jié)構(gòu)被較完整地保留，各項指標(biāo)如“優(yōu)”等率、孔隙率、含水率、酶解率優(yōu)于傳統(tǒng)制備支架。
　　2.NT-3交聯(lián)脫細(xì)胞脊髓支架在ELISA法檢測