NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠脊髓全橫斷損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究旨在探討應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因修飾的雪旺細(xì)胞(Schwanncells，SCs)與NT-3受體TrkC基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCs)聯(lián)合移植治療大鼠脊髓全橫斷損傷，觀察這種治療策略能否更好地促進(jìn)受損傷的脊髓結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)，并分析其中可能的修復(fù)機(jī)制，為臨床上治療急性脊髓損傷提供新的治療策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究分為以

2、下三部分： (一)體外NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 目的：探討NT-3基因修飾的SCs和TrkC基因修飾的MSCs共培養(yǎng)對MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響。 方法：擴(kuò)增，純化重組腺病毒，并檢測病毒的滴度；培養(yǎng)純化MSCs和SCs；利用不同MOI值的AdvLacZ體外進(jìn)行轉(zhuǎn)染MSCs，計(jì)算出AdvLacZ在MSCs中的轉(zhuǎn)染效率，并從中選擇最合

3、適的MOI值，利用不同MOI值的AdvGFP體外進(jìn)行轉(zhuǎn)染SCs，可計(jì)算出AdvGFP在SCs中的轉(zhuǎn)染效率，并從中選擇最合適的MOI值；分別用腺病毒載體介導(dǎo)的NT-3基因和TrkC基因轉(zhuǎn)染SCs和MSCs，用ELISA法檢測SCs內(nèi)NT-3的分泌，用免疫組化檢測MSCs內(nèi)TrkC的表達(dá)；體外分為MSCs組、MSCs+SCs組、MSCs+NT-3-SCs組、TrkC-MSCs組、TrkC-MSCs+SCs組、TrkC-MSCs+NT-3-S

4、Cs組和LacZ-MSCs+LacZ-SCs組，7d后觀察MSCs的分化情況，用巢蛋白(nestin)、β微管蛋白III(β-tubulinIII)、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、突觸后膜致密區(qū)蛋白(PSD95)等抗體免疫熒光組織化學(xué)染色，鑒定MSCs分化的細(xì)胞表型。 結(jié)果：1.通過腺病毒的擴(kuò)增和純化，獲得了高滴度的lacZ基因、NT-3基因和TrkC基因的重組腺病毒。2.MSCs和SCs最適感染劑

5、量分別是300和100。3.ELISA結(jié)果顯示，NT-3-SCs培養(yǎng)液中NT-3的含量明顯高于lacZ-SCs和未基因修飾的SCs。4.在培養(yǎng)7d后觀察，體外培養(yǎng)的MSCs經(jīng)與SCs共培養(yǎng)后能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠表達(dá)MAP2和PSD95等神經(jīng)元標(biāo)記物，而不表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP。在TrkC-MSCs+NT-3-SCs組，MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的百分率(32.9％)明顯高于其它組。 結(jié)論：NT-3基因修飾的

6、SCs和TrkC基因修飾的MSCs共培養(yǎng)能夠促進(jìn)MSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。 (二)PLGA三維支架內(nèi)NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞 目的：探討PLGA三維支架內(nèi)NT-3基因修飾的SCs和TrkC基因修飾的MSCs共培養(yǎng)對MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響。 方法：選P3～P5代MSCs，在體外分別種植于納米

7、纖維支架-聚L-乳酸(PLLA)，7孔聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)和16孔PLGA中，用掃描電鏡、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及MTT等技術(shù)檢測細(xì)胞活力與生長情況。同時(shí)，將NT-3基因修飾的SCs和TrkC基因修飾的MSCs種植在16孔PLGA支架內(nèi)，用免疫熒光組織化學(xué)染色檢測MSCs內(nèi)TrkC基因和SCs內(nèi)NT-3基因的表達(dá)，并進(jìn)一步用Westernblot檢測TrkC-MSCs組內(nèi)TrkC基因的表達(dá)。將細(xì)胞種植在16孔PLGA三維支

8、架7d后，觀察MSCs分化的情況。本實(shí)驗(yàn)分為MSCs組、MSCs+SCs組、MSCs+NT-3-SCs組、TrkC-MSCs組、TrkC-MSCs+SCs組、TrkC-MSCs+NT-3-SCs組和LacZ-MSCs+LacZ-SCs組，用nestin、β-tubulinIII、MAP2、PSD95、GFAP等抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定已分化的細(xì)胞表型；用Westernblot進(jìn)一步檢測β-tubulinIII的表達(dá)；同時(shí)將含細(xì)胞的PLG

9、A支架固定，借助電鏡觀察PLGA支架內(nèi)MSCs的分化情況。 結(jié)果：1.在掃描電鏡和熒光顯微鏡下，均可以觀察到MSCs在各種支架內(nèi)存活與生長，其中在PLGA支架的細(xì)胞數(shù)量多，且分布較均勻。2.MTT檢測結(jié)果顯示，MSCs在16孔PLGA支架內(nèi)生長活力最好。3.種植在PLGA支架的TrkC-MSCs和NT-3-SCs分別顯示TrkC和NT-3陽性表達(dá)。4.在TrkC-MSCs與NT3-SCs組，種植在PLGA支架的MSCs分化為神經(jīng)

10、元樣細(xì)胞的的百分率(46.42％)明顯高于其它組，且比共培養(yǎng)(TrkC-MSCs+NT3-SCs)在二維孔板內(nèi)的MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的百分率更高。5.電鏡下觀察到，NT-3-SCs+TrkC-MSCs組的神經(jīng)元樣細(xì)胞間有突觸樣結(jié)構(gòu)形成。 結(jié)論：在PLGA三維支架內(nèi)，NT-3基因修飾SCs和TrkC基因修飾MSCs共培養(yǎng)能夠促進(jìn)MSCs向具有形成突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，與二維孔板共培養(yǎng)相比，MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的百

11、分率有所提高。 (三)NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)大鼠全橫斷脊髓損傷結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討NT-3基因修飾SCs與TrkC基因修飾MSCs聯(lián)合移植對大鼠全橫斷脊髓損傷結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的影響。 方法：88只SD大鼠分為11組，正常對照組、實(shí)驗(yàn)對照組、MSCs組、MSCs+SCs組、LacZ-MSCs+LacZ-SCs組、MSCs+NT-3-SCs組、TrkC-M

12、SCs組、TrkC-MSCs+SCs組、TrkC-MSCs+NT-3-SCs組、SCs組和NT-3-SCs組。暴露大鼠胸10脊髓段做全橫斷損傷，其中實(shí)驗(yàn)對照組在損傷處移植PLGA。其它實(shí)驗(yàn)組移植相應(yīng)的細(xì)胞-PLGA復(fù)合體。術(shù)后動(dòng)物存活60d，然后進(jìn)行BBB評分、爬網(wǎng)格測試。再重新暴露胸11脊髓段，在離橫斷處下方1個(gè)脊髓節(jié)段處注射熒光金(FG)后再讓動(dòng)物存活7d。另一些動(dòng)物在大腦皮質(zhì)注射BDA后再存活14d。動(dòng)物被檢測體感誘發(fā)電位和脊髓誘

13、發(fā)電位后，灌注固定、取材，進(jìn)行組織切片和免疫熒光組織化學(xué)染色等形態(tài)學(xué)檢測。 結(jié)果：1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)2個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，各組動(dòng)物移植在脊髓損傷處的MSCs能夠存活和遷移。2.移植在脊髓損傷處的基因修飾MSCs和SCs，均能表達(dá)外源基因產(chǎn)物。3.與其它移植組相比，在TrkC-MSCs+NT-3-SCs組中，移植的MSCs分化為MAP2、PSD95及MOSP陽性細(xì)胞的百分率明顯增高，能更好地促進(jìn)MSCs分化為具有形成突觸潛能神經(jīng)元樣細(xì)胞以及少突

14、膠質(zhì)樣細(xì)胞。4.在各細(xì)胞移植組中，脊髓損傷區(qū)內(nèi)均可觀察到CGRP、GAP-43、5-HT及NF-200陽性神經(jīng)纖維。在TrkC-MSCs+NT-3-SCs組，這些陽性神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯增多。這表明NT-3基因修飾SCs與TrkC基因修飾MSCs聯(lián)合移植能明顯促進(jìn)神經(jīng)纖維再生。5.實(shí)驗(yàn)對照組在距離脊髓損傷處較遠(yuǎn)頭側(cè)組織有BDA標(biāo)記神經(jīng)纖維，一些移植組在距離脊髓損傷處較近頭側(cè)組織能觀察到BDA標(biāo)記的神經(jīng)纖維，在TrkC-MSC+NT-3-S

15、Cs組，可觀察到BDA標(biāo)記神經(jīng)纖維延伸到脊髓損傷處。一些移植組的中腦紅核及大腦皮質(zhì)體感運(yùn)動(dòng)區(qū)內(nèi)椎體細(xì)胞層有少量FG標(biāo)記神經(jīng)元，而在TrkC-MSCs+NT-3-SCs組，這兩個(gè)部位的FG標(biāo)記神經(jīng)元較為明顯。6.與其它移植組相比，TrkC-MSCs+NT-3一SCs組2個(gè)月后脊髓損傷區(qū)及損傷與宿主交界處MBP陽性髓鞘斷面增加；脊髓損傷處CSPGs表達(dá)減少，而laminin表達(dá)增加。7.與其它移植組相比，TrkC-MSCs+NT-3-SCs