宮頸癌中Pin1過表達對cyclin D1調節(jié)及其在宮頸癌細胞增殖凋亡的作用機制研究.pdf

1、蛋白質序列中絲/蘇-脯氨?；虻牧姿峄且粋€重要的細胞內信號機制，主要關系到細胞增殖和轉化。近年來研究發(fā)現：磷酸化的絲/蘇-脯氨酰基序還需要被Pin1特異識別催化，依賴Pin1的構型轉變是新的蛋白磷酸化后調節(jié)機制，對細胞增殖和惡性轉化起著非常重要的調節(jié)作用，其功能失調可導致細胞轉化和腫瘤發(fā)生。Pin1在人類多種腫瘤中存在過表達，對多種致癌信號具有協同加強作用，被稱為腫瘤發(fā)生發(fā)展的“催化分子”。Pin1過表達在實體瘤如乳腺癌、前列腺癌發(fā)生

2、中起關鍵的催化作用，且與臨床預后密切相關。宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，屬于實體瘤，是導致婦女發(fā)生癌相關死亡的首要原因。盡管宮頸癌發(fā)生的確切的分子機制并不清楚，但研究表明：HPV與宮頸癌關系密切，在HPVE6/E7致癌信號通路中，多種癌信號分子因含有共同的絲/蘇-脯氨?；蚩赡苁躊in1特異性調控，如cyclinD1，Ki67，P53NF-κB等，其中cyclinD1過度表達可加速細胞增殖，在HPVE6/E7致癌中扮演著重要角色，cyc

3、linD1是HPVE6/E7致癌所必不可少的成分。體內、外研究顯示：刪除cyclinD1，則HPVE6/E7不能誘導正常細胞轉化增殖。但cyclinD1過表達的機制不明。有趣的是Pin1過表達不僅在轉錄水平促進cyclinD1表達，而且還通過催化cyclinD1發(fā)生順反異構，阻止其降解，導致cyclinD1蓄積于細胞核內，處于持續(xù)激活狀態(tài)，加速乳腺上皮細胞增殖和腫瘤發(fā)生。推測Pin1可能也作為催化分子經上調cyclinD1參與宮頸癌發(fā)生

4、，Pin1過表達過度激活cyclinD1可加強致癌信號、擾亂細胞內信號穩(wěn)態(tài)，可能是引起宮頸上皮細胞發(fā)生惡性轉化和增殖失控的重要因素。然而，Pin1在宮頸癌中表達及其與cyclinD1關系的研究尚未見報道，阻抑Pin1是否影響宮頸癌細胞增殖和腫瘤形成亦不清楚。因此本課題擬進行如下研究： 目的：1.明確Pin1、cyclinD1在宮頸癌中的表達狀況及其臨床意義；2.研究Pin1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及對cyclinD1表達的影

5、響；3.探索靶向Pin1基因沉默阻抑宮頸癌發(fā)生和細胞增殖的可能性。 方法：1.免疫組織化學法檢測57例宮頸癌，21例CIN，10例正常宮頸組織中Pin1，cyclinD1和Ki67的表達，分析其相關性及臨床意義；同時RT-PCR法檢測其中15例宮頸癌，5例正常宮頸組織中Pin1mRNA的表達； 2.RT-PCR，免疫印跡法和免疫細胞化學法檢測4株宮頸癌細胞HeLa，Siha，C33a，Caski中Pin1mRNA和蛋白的

6、表達； 3.構建Pin1正義質粒，上調Pin1基因表達；免疫印跡法，MTT比色法，軟瓊脂克隆形成實驗，流式細胞儀分析上調Pin1基因對cyclinD1表達及宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響； 4.應用RNA干擾技術，短發(fā)夾狀RNA特異性沉默Pin1基因表達；免疫印跡法，MTT比色法，軟瓊脂克隆形成實驗，流式細胞儀分析下調Pin1基因對cyclinD1表達及宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響。 結果：1.宮頸癌組織中Pin1mR

7、NA和蛋白表達明顯高于正常宮頸組織(p＜0.05)；從正常宮頸到CIN再到浸潤癌Pin1蛋白表達逐漸增強(p＜0.05)；Pin1蛋白過表達與臨床分期、病理分級、淋巴結轉移無明顯相關(p＞0.05)；但宮頸腺癌中Pin1表達明顯高于宮頸鱗癌(p＜0.05)；Pin1過表達與cyclinD1，Ki67表達密切相關(p＜0.05)。 2.HeLa、Siha、C33a、Caski宮頸癌細胞株存在不同程度Pin1mRNA及蛋白過表達(p

8、＜0.05)。 3.在宮頸癌HeLa細胞中，上調Pin1可增加內源性cyclinD1表達，下調Pin1可降低內源性cyclinD1表達(p＜0.05)。 4.特異性沉默Pin1基因可阻抑宮頸癌細胞增殖并誘導凋亡(p＜0.05)；外源性增加Pin1基因表達對宮頸癌細胞增殖和凋亡無明顯影響(p＞0.05)。 結論：1.Pin1在宮頸癌組織和細胞中均存在mRNA及蛋白水平上的過表達，Pin1過表達與cyclinD1，K