HPV L1在宮頸癌CaSki和HeLa細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、　　目的：本課題應(yīng)用HPV L1的通用型引物對(duì)培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞CaSki、HeLa的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增,以明確其是否有L1的表達(dá)；應(yīng)用兩種針對(duì)HPV L1蛋白的抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè),從基因和蛋白水平研究HPV L1在兩種細(xì)胞中的存在情況,了解其與宮頸癌的發(fā)生有無(wú)相關(guān)性,為將L1作為宮頸癌及其它HPV所致腫瘤的免疫檢測(cè)和免疫治療的靶標(biāo)物質(zhì)的可能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)比較本課題組制備的兔多抗血清與小鼠抗HPV L1單克隆抗體(可檢測(cè)HPV1、6、1

2、1、16、18、31)在檢測(cè)HPV16、18、31型時(shí)是否有相同的檢測(cè)能力。
　　方法：(1)培養(yǎng)CaSki、HeLa及HaCaT細(xì)胞,提取細(xì)胞mRNA及細(xì)胞總蛋白。(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞CaSki、HeLa是否有HPV L1 mRNA的表達(dá)。(3)應(yīng)用HPV L1兔多抗血清及小鼠抗HPV L1單克隆抗體(可檢測(cè)HPV1、6、11、16、18、31)通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)方法和免疫組織化學(xué)法對(duì)

3、宮頸癌細(xì)胞CaSki、HeLa中L1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。以昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組HPV31 L1蛋白作對(duì)照。并比較本課題組制備的兔多抗血清與小鼠抗HPV L1單克隆抗體(可檢測(cè)HPV1、6、11、16、18、31)在檢測(cè)HPV 16、18、31型時(shí)是否有相同的檢測(cè)能力。
　　結(jié)果：(1)成功培養(yǎng)了CaSki、HeLa及HaCaT細(xì)胞并提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞mRNA及細(xì)胞總蛋白。(2)實(shí)時(shí)定量PCR通過(guò)HPV

4、L1的通用引物MY09/11、GP5+/6+引物對(duì)CaSki、HeLa細(xì)胞的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性。(3)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)方法檢測(cè)結(jié)果顯示HPV31 L1重組蛋白在55KD處出現(xiàn)條帶,CaSki、HeLa細(xì)胞在80KD處出現(xiàn)條帶；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CaSki、HeLa細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞漿及細(xì)胞質(zhì)均出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。(4)HPV L1兔多抗血清和小鼠抗HPV L1單克隆抗體均在檢測(cè)HPV 16、18、31型時(shí)均為陽(yáng)性。