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文檔簡介
1、本研究通過構(gòu)建真核表達(dá)系統(tǒng)及雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),分別對EDN1 SNP rs5370與EPO SNP rs551238多態(tài)位點的生物功能進(jìn)行分析,擬闡明該多態(tài)位點的作用機制,為此兩個多態(tài)位點作為遺傳分子標(biāo)記提供科學(xué)依據(jù)。
研究一:全基因組合成EDN1 GG基因型cDNA序列,并連接至pcDNA3.1(+),構(gòu)建GG型重組質(zhì)粒?;蚨c突變方法構(gòu)建TT型重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染實驗分組:無質(zhì)粒對照組(B組);空質(zhì)粒對照組(C組);GG
2、基因型組(G組);TT基因型組(T組)。共計4組,轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,放射免疫方法檢測上清液ET含量。結(jié)果:重組質(zhì)粒測序比對結(jié)果顯示,GG、TT基因型序列與EDN1基因cDNA序列符合率100%,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。細(xì)胞培養(yǎng)上清液ET含量測定結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的ET-1濃度均高于對照組。GG基因型組ET-1濃度最高,且與空白組相比,有顯著性差異(P<0.05)。TT基因型組ET-1濃度低于GG基
3、因型組,TT基因型組與各組間相比,無顯著性差異。結(jié)論:EDN1 SNP rs5370對ET-1表達(dá)不明顯。
研究二:全基因組合成包含rs551238多態(tài)位點的增強子-啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,并將該重組調(diào)控元件連接至pGL3-basic質(zhì)粒,構(gòu)建相應(yīng)的熒光素酶報告基因載體。以pGL3-basic、pGL3-Promter、pGL3-EPO-G、pGL3-EPO-T共計4組分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞與HepG2細(xì)胞。采用Dual-Luci
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