含補腎中藥鼠血清對人胚胎干細胞體外分化為類卵巢顆粒細胞影響的研究.pdf

1、目的：觀察含補腎中藥鼠血清對人胚胎干細胞體外分化為類卵巢顆粒細胞的影響及可能的相關機制
　　第一部分：人胚胎干細胞體外分化為類卵巢顆粒細胞潛能的研究
　　方法：
　　人胚胎干細胞H9生長在飼養(yǎng)層細胞上形成克隆團，轉(zhuǎn)入超低吸附板形成擬胚體，擬胚體（加入BMP4，WNT3A，activin-A，bFGF）培養(yǎng)5天后細胞分組貼壁誘導分化7天，誘導因子組加入誘導因子，陰性對照組用干細胞完全培養(yǎng)液，將干細胞擬胚體定向誘導分化為類

2、卵巢顆粒細胞；在誘導分化的不同時間段，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，評價誘導分化的細胞形態(tài)學是否與人顆粒細胞相似，用免疫熒光染色及RT-PCR檢測卵巢顆粒細胞標志物的表達來鑒定誘導分化的細胞是否為顆粒細胞，酶聯(lián)免疫法檢測檢測細胞培養(yǎng)液中FSH刺激前后E2的含量，評價分化后的細胞的內(nèi)分泌功能，實驗重復三次。
　　結(jié)果：誘導分化后的H9細胞形態(tài)學與人顆粒細胞兩者在形態(tài)學上相似；細胞免疫熒光染色結(jié)果:誘導因子組的細胞表達較強的人卵巢顆粒細

3、胞標志物的熒光標記；分化后細胞對顆粒細胞特異性標志物的mRNA表達增強；誘導因子組細胞培養(yǎng)液中E2的濃度逐漸升高，在FSH作用下培養(yǎng)液中E2濃度明顯升高，與人顆粒細胞相似。而陰性組無論是細胞形態(tài)還是顆粒細胞標志物表達和E2的分泌都沒有明顯的變化。
　　小結(jié)：人胚胎干細胞H9在體外加入誘導因子后具有分化為類卵巢顆粒細胞的潛力；因此，H9可作為評價補腎中藥鼠血清對人胚胎干細胞體外分化為類卵巢顆粒細胞的影響的研究平臺。
　　第二部

4、分：含補腎中藥鼠血清對人胚胎干細胞體外分化為類卵巢顆粒細胞影響的研究
　　方法：
　　1、各類含補腎中藥鼠血清的制備：在體重均一的情況下隨機將60只大鼠分成6組：22號藥組、23號藥組、24號藥組、25號藥組，26號藥組、27號藥組，每組10只，雌雄各半?？瞻捉M大鼠灌服蒸餾水，補腎中藥組大鼠分別灌服對應號碼的中藥，給藥劑量均為5.0g/kg，給藥容量均為20ml/kg。分別于給藥后90min股動脈取血，血液靜置2小時后，30

5、00rpm離心15min，分離各組血清，HPLC分析血清，過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2、含組補腎中藥鼠血清誘導人胚胎干細胞體外分化為類卵巢顆粒細胞影響的研究：人胚胎干細胞形成克隆團、擬胚體（同上）后分組貼壁誘導分化，各組加入2％含補腎中藥鼠血清定向誘導分化7天；設Factor組為陽性對照組，Medium組為陰性對照組，在誘導分化的不同時間段（同第一部分）細胞形態(tài)學觀察、免疫熒光染色及RT-PCR檢測顆粒細胞標志物鑒定分化后

6、的細胞以及ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中FSH刺激前后E2的含量，評價分化后細胞的內(nèi)分泌功能。統(tǒng)計學分析比較各組參數(shù)之間的差異，實驗重復兩次。
　　結(jié)果：含補腎中藥鼠血清誘導分化后細胞形態(tài)學與人顆粒細胞在形態(tài)學上相似，各組補腎中藥鼠血清誘導分化的細胞能不同程度的表達人卵巢顆粒細胞標志物的免疫熒光標記；分化后的各組細胞對顆粒細胞特異性標志物mRNA表達增強，以25號、26號含補腎中藥鼠血清組的細胞表達尤為顯著；各組細胞（含23、25、2

7、6號、27號補腎中藥血清組）培養(yǎng)液中E2濃度均高于Factor組，在FSH作用下25、26號補腎中藥血清組誘導的細胞培養(yǎng)液中E2濃度升高尤為顯著(P<0.05)。
　　小結(jié)：補腎中藥具有在體外誘導人胚胎干細胞向卵巢顆粒細胞分化的能力，誘導分化后的類卵巢顆粒細胞有分泌E2的功能。6個樣品中有4個樣品誘導的細胞具有分泌E2功能，F(xiàn)SH刺激下2個樣品誘導的細胞分泌E2功能尤為顯著。
　　第三部分：含補腎中藥鼠血清誘導人胚胎干細胞體

8、外分化為類卵巢顆粒細胞的機理研究
　　方法：選擇上述實驗中：細胞培養(yǎng)液中E2濃度升高且在FSH作用下E2水平升高尤為顯著的、對顆粒細胞特異性標志物的mRNA表達顯著增強的25號、26號含補腎中藥鼠血清作為進一步的研究對象；細胞培養(yǎng)及擬胚體形成方法同第一、第二部分，在擬胚體貼壁后分別加入25號、26號補腎中藥鼠血清，在分化的第0天、第3天、第5天，收集細胞，RT-PCR檢測兩組補腎中藥誘導的細胞分化后卵巢顆粒細胞特異性基因FSHRm

9、RNA、CYP19A1mRNA、AMHmRNA以及通路相關的BMP6mRNA、SMAD8mRNA、bFGFmRNA的表達，實驗重復兩次。
　　結(jié)果：與第0天比較含25號、26號補腎中藥鼠血清體外誘導人胚胎干細胞擬胚體貼壁分化3天細胞BMP6mRNA、SMAD8mRNA的表達顯著升高，第5天下降；而兩組貼壁分化第0天到第5天卵巢顆粒細胞特異性標志物FSHRmRNA、CYP19A1mRNA、AMHmRNA以及bFGFmRNA表達均持續(xù)

10、升高。
　　結(jié)論：綜合以上實驗結(jié)果，我們可以得出一個結(jié)論：補腎中藥復方能在體外促進卵巢顆粒細胞的分化，BMP/Smads信號通路是補腎中藥促進人胚胎干細胞H9體外誘導分化為類卵巢顆粒細胞的可能通路之一；含25、26號補腎中藥鼠血清通過BMP/Smads信號通路的傳導，促進人胚胎干細胞H9體外誘導定向分化，分化的細胞具備類似人顆粒細胞的功能。這將為從細胞和分子水平來闡明補腎中藥在治療人類生殖功能障礙疾病（如卵巢早衰、卵巢儲備功能下降