胚胎干細(xì)胞體外分化為肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、建立胚胎干細(xì)胞體外分化肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)體系是開(kāi)展肝臟發(fā)育的細(xì)胞與分子調(diào)控機(jī)制、胚胎發(fā)育過(guò)程中中胚層和內(nèi)胚層間的相互作用規(guī)律以及肝細(xì)胞分化發(fā)育調(diào)控和相關(guān)疾病防治藥物篩選等研究的重要基礎(chǔ)，同時(shí)也可以為開(kāi)展肝細(xì)胞移植、肝組織工程、生物人工肝等研究提供有效的細(xì)胞來(lái)源，因此目前該方面的研究備受關(guān)注。本文首先建立了一種擬胚體形成的新方法，在此基礎(chǔ)上，利用不同細(xì)胞因子組合，通過(guò)擬胚體途徑成功誘導(dǎo)了胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，同時(shí)建立了組蛋白去乙?；敢种苿w

2、外直接誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的體系，并發(fā)現(xiàn)分化過(guò)程中伴隨細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，在此誘導(dǎo)分化過(guò)程中，首次分離鑒定到一類(lèi)新型的前體細(xì)胞，具有肝干/祖細(xì)胞的典型標(biāo)志和雙分化潛能，從而為肝臟早期發(fā)育調(diào)控的細(xì)胞與分子機(jī)制等研究提供了良好的體外模型。 當(dāng)前，有關(guān)胚胎干細(xì)胞分化各種不同譜系細(xì)胞的研究多通過(guò)擬胚體途徑模擬早期胚胎發(fā)育過(guò)程來(lái)進(jìn)行，因此擬胚體常作為胚胎發(fā)育尤其是早期譜系決定、胚層相互誘導(dǎo)等研究的體外模型。我們以小鼠ES-D3細(xì)胞

3、系為材料，利用SIM小鼠來(lái)源的ST0成纖維細(xì)胞系，建立了一種飼養(yǎng)層細(xì)胞介導(dǎo)的擬胚體形成新方法。與傳統(tǒng)擬胚體制作方法相比，具有操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)體系和結(jié)果穩(wěn)定，可以大量獲取擬胚體等優(yōu)點(diǎn)，得到的擬胚體70％以上都可以發(fā)育形成成熟的囊狀擬胚體，分化潛能研究顯示其具有分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等三胚層來(lái)源細(xì)胞的能力，在此基礎(chǔ)上，利用aFGF、bFGF和BMP4等細(xì)胞因子組合，成功誘導(dǎo)了胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，并發(fā)現(xiàn)由橫膈間充質(zhì)分泌的BMP4可

4、以顯著增強(qiáng)肝細(xì)胞的分化，在早期誘導(dǎo)信號(hào)中，aFGF和bFGF的作用類(lèi)似。 與細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑相比，化學(xué)合成的誘導(dǎo)劑具有半衰期長(zhǎng)、作用穩(wěn)定、效應(yīng)明確等特點(diǎn)，更適合于干細(xì)胞的長(zhǎng)期分化誘導(dǎo)過(guò)程。我們采用丁酸鈉和丙戊酸鈉兩種HDAC抑制劑作為肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，成功建立了胚胎干細(xì)胞體外直接分化肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)體系，并發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑在誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化過(guò)程中伴隨著細(xì)胞周期阻滯和凋亡，其中CDK抑制劑p21Waf1可能參與了HDAC抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞

5、周期阻滯。鑒于胚胎干細(xì)胞具有正常細(xì)胞和癌細(xì)胞兩方面的特性，HDAC抑制劑誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化可以作為研究組蛋白(去)乙?；揎椪{(diào)控基因表達(dá)的模型。在HDAC抑制劑誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化過(guò)程中，我們還首次分離鑒定到一類(lèi)新型的前體細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞表達(dá)肝干/祖細(xì)胞的典型標(biāo)志，具有向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙分化潛能，且分化得到的成熟肝細(xì)胞具有白蛋白、糖原合成，細(xì)胞色素P450活性，對(duì)CCl4引起的小鼠肝損傷具有一定的修復(fù)作用，因此可以為肝組織工程