COX-2過表達載體的構建及其在HSCs中的表達.pdf

1、目的：構建COX-2過表達載體，并轉染至HSC-T6中觀察其表達情況，為進一步研究 COX-2與HSC生物學功能的關系提供前期準備。
　　方法：1.調取 COX-2鼠源全長基因，TRIzol法抽提大鼠肝總 mRNA,逆轉錄為cDNA建立文庫。
　　2.用RT-PCR擴增得到COX-2目的片段，PCR產物和pcDNA3.1(+)質粒雙酶切處理后將 COX-2基因片段連接至pcDNA3.1(+)載體上，將構建成的pcDNA3.1

2、(+)-rCOX-2轉化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，在含50μg/ml Kana LB固體平皿上篩選陽性克隆菌株。
　　3.篩選后再對pcDNA3.1(+)-rCOX-2進行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定和測序的分析。
　　4.將構建成功的pcDNA3.1(+)-rCOX-2表達載體經脂質體轉染入HSC-T6細胞，進行實驗分組：HSC-T6細胞組（空白組），pcDNA3.1(+)-rCOX-2組（COX-2過表達組）；pcD

3、NA3.1（+）組（空載體組）。轉染48小時后應用Real-time PCR檢測表達載體在HSC-T6中COX-2 mRNA的表達情況。
　　結果：1.RT-PCR產物顯示在1800 bp左右出現(xiàn)目的條帶。
　　2.將所得的目的基因酶切鑒定及序列分析，測序結果表明和GenBank的COX-2基因序列一致，pcDNA3.1(+)-rCOX-2表達載體構建成功。
　　3. pcDNA3.1(+)-rCOX-2表達載體轉染入