細胞因子TWEAK及BAFF在多發(fā)性肌炎和皮肌炎發(fā)病中的作用.pdf

1、特發(fā)性炎性肌病是一類主要累及骨骼肌組織的自身免疫性疾病，多發(fā)性肌炎和皮肌炎是最常見的兩個疾病亞型?；颊吲R床上突出表現(xiàn)為肌無力與肌肉耐力降低、血清肌酸激酶升高、產(chǎn)生自身抗體、肌肉組織中發(fā)生炎性細胞浸潤，還會累及肺臟、心臟、腎臟、皮膚等多個臟器。多發(fā)性肌炎和皮肌炎已成為危害我國人民群眾身體健康的重大疾病之一，但其病因和發(fā)病機制仍不明確?，F(xiàn)在普遍認為天然免疫、獲得性免疫、以及非免疫學機制共同作用，導致肌炎患者骨骼肌損傷。
　　腫瘤壞死因

2、子樣凋亡弱誘導物(TWEAK)是腫瘤壞死因子超家族成員，是一種多功能細胞因子，通過結(jié)合并活化其受體Fn14參與多種細胞生理過程的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病如類風濕關(guān)節(jié)炎、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡中TWEAK表達異常，提示TWEAK在自身免疫病中可能具有重要的作用。但是，TWEAK-Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者中的表達情況仍不清楚。因此，為了研究TWEAK-Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎發(fā)病機制中的可能作用，我們檢測了多發(fā)性肌炎和皮

3、肌炎患者血清及肌肉組織中TWEAK-Fn14的表達水平，并初步探討了TWEAK對成肌細胞的刺激效應(yīng)，為闡明TWEAK-Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎中的作用提供實驗證據(jù)。
　　現(xiàn)有的多發(fā)性肌炎和皮肌炎血清生物標記物，包括血清肌酸激酶、自身抗體、細胞因子等，均不能理想的反映全部患者的疾病活動情況。因此，研究和探索新的血清標記物，對于更好的評估患者疾病活動性、指導患者的臨床治療和預后評估，具有重要的意義。B細胞活化因子(BAFF)是腫瘤

4、壞死因子超家族成員之一，研究證實BAFF水平在多種自身免疫性疾病中表達顯著升高并且可能作為指示疾病活動性的血清標記物。但是，中國人群多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF表達水平及其與患者疾病活動度的相關(guān)性仍不清楚。為此，本研究擬檢測多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度并分析其臨床相關(guān)性;同時，通過設(shè)計橫斷面研究和隨訪研究，證實多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度和患者疾病活動度的相關(guān)性，進而闡明血清BAFF濃度作為患者疾病活動性評估的

5、血清生物標記物的臨床應(yīng)用價值。
　　本研究獲得主要研究結(jié)果如下:
　　一.TWEAK及其受體Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎中的表達及在發(fā)病機制的作用
　　1.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清TWEAK水平的檢測
　　通過檢測98例多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者、37例健康對照血清TWEAK濃度，發(fā)現(xiàn)患者組血清TWEAK水平（中位數(shù)442 pg/ml，range81-1385 pg/ml）顯著低于較健康對照組（中位數(shù)516 pg/

6、ml，range282-797 pg/ml，P＜0.001）;血清TWEAK濃度在多發(fā)性肌炎患者組和皮肌炎患者組之間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。臨床相關(guān)性分析顯示患者血清TWEAK濃度與自身抗體、血清CK濃度、患者的臨床癥狀（肺間質(zhì)病變、吞咽困難、技工手、雷諾現(xiàn)象等）均無顯著相關(guān)性(P均＞0.05)。
　　橫斷面研究結(jié)果顯示患者血清TWEAK濃度與疾病活動性評分無顯著相關(guān)性（P均＞0.05）;對12例新發(fā)病患者治療前后的血清T

7、WEAK濃度和疾病活動度評分進行分析，結(jié)果顯示治療之后，患者疾病活動性評分顯著下降(P＜0.01)，但是患者血清TWEAK水平并不隨著疾病活動度下降而變化。
　　2.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織中Fn14 mRNA表達水平顯著升高
　　取17例多發(fā)性肌炎、19例皮肌炎患者、以及10例無肌病創(chuàng)傷患者的骨骼肌組織，進行定量RT-PCR方法檢測TWEAK、Fn14的mRNA水平，結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉TWEAK m

8、RNA水平與對照組無顯著差異(P＞0.05);而患者肌肉中Fn14 mRNA水平顯著高于健康對照(P＜0.01);并且，多發(fā)性肌炎患者組和皮肌炎患者組Fn14mRNA水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。我們發(fā)現(xiàn)，合并吞咽困難的多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉Fn14 mRNA水平顯著高于未合并吞咽困難的患者(P＜0.01)。此外，患者肌肉Fn14 mRNA水平與肌肉活動性評分顯著相關(guān)(r=0.512，P＜0.01)，但是與總活動性評分不相關(guān)(P

9、＞0.05)。
　　3.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者骨骼肌組織中TWEAK、Fn14蛋白表達檢測
　　利用間接免疫熒光法檢測了10例多發(fā)性肌炎、13例皮肌炎、7例健康對照肌肉組織中TWEAK、Fn14蛋白的表達，結(jié)果顯示:多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者患者肌肉組織中，可檢測到高表達TWEAK和Fn14蛋白，健康對照肌肉組織中未檢測到TWEAK、Fn14蛋白的明顯表達;此外，在多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織中，TWEAK蛋白主要由浸潤的淋巴

10、細胞表達，但是在肌細胞膜上也可以檢測到TWEAK蛋白，而Fn14主要表達于肌細胞膜表面。因此免疫熒光雙重染色共表達分析中，可見TWEAK和Fn14常常同時出現(xiàn)在肌細胞膜表面。
　　4.TWEAK刺激成肌細胞的功能研究
　　體外培養(yǎng)的人骨骼肌成肌細胞經(jīng)高濃度TWEAK蛋白(100ng/ml)刺激48小時后，Western Blot等方法檢測成肌細胞的MHC-Ⅰ類分子表達情況，以及成肌細胞再生分化、凋亡、自噬等水平。結(jié)果顯示經(jīng)T

11、WEAK蛋白刺激后，成肌細胞再生分化、凋亡水平均未發(fā)生明顯變化;但是，TWEAK蛋白刺激后，成肌細胞MHC-Ⅰ類分子表達顯著上調(diào);并且自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1表達升高，提示TWEAK刺激后，成肌細胞自噬程度顯著增強。
　　二.BAFF作為多發(fā)性肌炎和皮肌炎血清生物標記物的臨床研究
　　1.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF水平
　　采用定量ELISA法檢測41例多發(fā)性肌炎、51例皮肌炎患者、25例健康對照血

12、清中BAFF濃度，結(jié)果顯示多發(fā)性肌炎患者(中位數(shù)1627.5 pg/ml，range239.2-19950 pg/ml，P＜0.001)和皮肌炎患者(中位數(shù)1582.5 pg/ml，range506.5-18360 pg/ml，P＜0.001)血清BAFF水平均顯著高于健康對照(中位數(shù)842pg/ml，range512-1354 pg/ml)。另外，統(tǒng)計結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎患者組和皮肌炎患者組之間血清BAFF水平無顯著差異(P＞0.05

13、)。
　　2.患者血清BAFF水平與臨床癥狀及實驗室檢查的相關(guān)性分析
　　多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度與臨床表現(xiàn)相關(guān)性分析結(jié)果顯示合并ILD患者組間血清BAFF濃度(49例PM/DM患者，中位數(shù)2472 pg/ml，range497.5-19950 pg/ml)顯著高于未合并ILD患者組(43例PM/DM患者，中位數(shù)1105 pg/ml，range239.2-6150pg/ml)(P＜0.001)。四格表x2檢驗結(jié)

14、果顯示，血清BAFF濃度升高的患者合并ILD的比例顯著高于血清BAFF濃度正常的患者(x2value=20.886,P＜0.001)。根據(jù)患者的其它臨床癥狀如吞咽困難、雷諾現(xiàn)象、技工手、關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)與否進行分組，結(jié)果顯示組間血清BAFF水平差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。
　　多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度與實驗室檢查相關(guān)性分析結(jié)果顯示ANA陽性患者組血清BAFF濃度(39例患者，中位數(shù)1929 pg/ml，rang

15、e506.5-19950 pg/ml)顯著高于ANA陰性組患者（53例患者，中位數(shù)1533pg/ml，range239.2-12865 pg/ml）(P＜0.05);抗Jo-1抗體陽性組患者血清BAFF濃度(21例患者，中位數(shù)3838pg/ml，range1385.5-19950 pg/ml)顯著高于抗Jo-1抗體陰性組患者（71例患者，中位數(shù)1348.5 pg/ml，range239.2-18360 pg/ml）(P＜0.001);并

16、且患者的血清BAFF水平與血清抗Jo-1抗體濃度具有顯著的統(tǒng)計學相關(guān)性(r=0.822，P＜0.001)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF水平與血清CK濃度呈顯著性正相關(guān)（r值分別為0.675，0.723，P均＜0.01）。
　　對49例多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者的血清BAFF濃度和淋巴細胞亞群進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度與CD3+T細胞數(shù)呈顯著性負相關(guān)(r=-0.334，P＜0

17、.05)，與CD3+CD4+T細胞數(shù)顯著負相關(guān)(r=-0.302，P＜0.05)，與CD3+CD8+T細胞數(shù)顯著負相關(guān)(r=-0.320，P＜0.05)，并且與CD19+CD5-B細胞數(shù)顯著負相關(guān)(r=-0.322，P＜0.05)。此外，血清BAFF濃度與NK細胞數(shù)無統(tǒng)計學相關(guān)性(r=0.047，P＞0.05)。
　　3.患者血清BAFF水平與疾病活動度的相關(guān)性分析:橫斷面研究
　　在收集患者血清標本的同時，采用肌炎活動評估

18、視覺模擬評分(MYOACT)工具對患者的疾病活動度分別進行評分，經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗分析，結(jié)果顯示多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者組血清BAFF濃度都和其MYOACT總疾病活動度評分呈顯著正相關(guān)（r值分別為0.481、0.536;P均＜0.01）;并且血清BAFF濃度還與肌肉疾病活動度正相關(guān)（r分別為0.257、0.354，P均＜0.05）。此外，對于皮肌炎患者，我們還發(fā)現(xiàn)血清BAFF濃度與皮膚疾病活動度顯著相關(guān)(r=0.354，P＜0.

19、05)。
　　4.患者血清BAFF水平與疾病活動度的相關(guān)性分析:隨訪研究
　　隨訪研究中，我們對24名多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者進行隨訪，每名患者的隨訪次數(shù)為2-7次不等，隨訪時間間隔在6個月至6年不等，每次隨訪均收集患者的血清標本，同時對患者疾病活動度進行MYOACT評分。其中20名患者被隨訪了超過2年，并且每名患者隨訪次數(shù)超過3次。對隨訪研究中收集到的73份血清標本和對應(yīng)的疾病活動度評分進行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)患者血清BAF

20、F濃度和患者MYOACT總疾病活動度評分顯著正相關(guān)(r=0.68， P＜0.001)，并且和MYOACT肌肉活動度評分同樣顯著正相關(guān)(r=0.533， P＜0.001)。22名新發(fā)病未治療的患者，經(jīng)治療達到緩解期后，隨著疾病活動度評分顯著下降(P＜0.001)，患者血清BAFF濃度也顯著降低(P＜0.001);并且治療前后患者血清BAFF濃度下降值和疾病活動度評分下降值具有顯著統(tǒng)計學相關(guān)性(r=0.434,P＜0.05)。
　　總

21、之，本研究結(jié)果表明多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者TWEAK-Fn14表達異常，尤其是在肌肉組織中，TWEAK-Fn14表達顯著上調(diào)，提示多發(fā)性肌炎和皮肌炎骨骼肌組織中浸潤的淋巴細胞可能通過表達炎性細胞因子TWEAK，與肌細胞表面高表達的Fn14相互作用，活化下游信號通路，誘導骨骼肌細胞損傷。通過體外實驗，我們還證實TWEAK蛋白刺激后，成肌細胞MHC-Ⅰ類分子和自噬相關(guān)蛋白表達顯著升高，進一步提示TWEAK-Fn14參與多發(fā)性肌炎和皮肌炎的骨骼