2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究目的:
  鉀通道為目前發(fā)現(xiàn)亞型最多、結(jié)構(gòu)與功能最為復(fù)雜的一類離子通道,因其選擇性通透鉀離子特性而得名。鉀通道廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),同時(shí)外周如骨骼肌、心臟、血管、氣管及腺體細(xì)胞等也有表達(dá)。生理功能上,鉀通道主要參與維持細(xì)胞膜電位,調(diào)節(jié)可興奮細(xì)胞的興奮性,以及平滑肌的舒縮等過程。
  TREK-2(TWIK Reelated K+ channel2,又稱K2P10.1)為K2P家族成員之一,高表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在外周神

2、經(jīng)系統(tǒng)和外周組織也有分布。在傳統(tǒng)鉀通道的離子電導(dǎo)通路上,從內(nèi)到外依次排列著內(nèi)門和外門,(又稱C-型門,或失活門)。離子通道調(diào)控的門控機(jī)制是指離子電導(dǎo)通路通過移動(dòng)特定的門控元件,或變化空間構(gòu)象發(fā)生來實(shí)現(xiàn)對(duì)離子流入或流出的調(diào)控。
  TREK-2的第二和第四跨膜片段同樣存在甘氨酸鉸鏈,但此甘氨酸鉸鏈?zhǔn)欠裨趦?nèi)門活動(dòng)中發(fā)揮功能?TREK-2通道中內(nèi)門和外門是否存在耦聯(lián)關(guān)系?TREK-2的C末端(Ct)是否影響門控機(jī)制及其可能的方式如何?T

3、REK-2的Nt是否影響其離子選擇器的構(gòu)象?本研究應(yīng)用TREK-2激動(dòng)劑2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-Aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)、胞外酸(pHo)和Ba2+作為工具,結(jié)合分子生物學(xué)和雙電極電壓鉗技術(shù),探討以上幾點(diǎn)未知問題,以期豐富TREK-2的門控機(jī)制理論。
  研究方法:
  (1)質(zhì)粒構(gòu)建,通道表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中和雙電極電壓鉗記錄電流構(gòu)建可以在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中高表達(dá)的pGH

4、-19-TREK-2和pGH-19-TREK-1重組質(zhì)粒。根據(jù)研究目的的不同,應(yīng)用PCR技術(shù)構(gòu)建一系列結(jié)構(gòu)不同的突變體、缺失體、嵌合體和串聯(lián)二聚體,其中串聯(lián)體的兩個(gè)亞基應(yīng)用一個(gè)可靈活變動(dòng)的多肽連接,多肽氨基酸序列為AAAGSGGSGGSTGGSSGSSGS,以上各種突變體、缺失體、嵌合體和串聯(lián)體質(zhì)粒均經(jīng)過DNA測(cè)序,結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以保證DNA序列正確。以上各種質(zhì)粒應(yīng)用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切線性化,然后體外轉(zhuǎn)錄成cRNA,cRNA顯微

5、注射至非洲爪蟾卵母細(xì)胞,培養(yǎng)1-3天后,應(yīng)用雙電極電壓鉗技術(shù),將細(xì)胞膜電位鉗制在-80 mV,應(yīng)用Ramp模式從-120mV去極化至+60 mV,時(shí)間150 ms,記錄電流,觀察它們?cè)谏礅涬x子濃度(5mM)或者其他鉀離子濃度(0 mM、20 mM或40 mM)條件下,對(duì)胞外給予不同濃度的2-APB或Ba2+的反應(yīng),以及它們對(duì)不同pH細(xì)胞外液的反應(yīng)。
  研究結(jié)果:
  一、TREK-2內(nèi)門對(duì)外門的調(diào)控作用
 ?。ㄒ唬?/p>

6、2-APB激活TREK-2通道的機(jī)制研究
  1)2-APB通過作用于TREK-2的C末端發(fā)揮其激活功能。
  2)C末端近側(cè)區(qū)為2-APB與TREK-2相互作用所必需,而遠(yuǎn)側(cè)區(qū)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
  根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果,TREK-1和TREK-2的Ct近側(cè)區(qū)(proximal Ct,pCt)相對(duì)保守,而遠(yuǎn)側(cè)區(qū)(distal Ct,dCt)同源性較低。然而,缺失遠(yuǎn)側(cè)區(qū)導(dǎo)致TREK-2對(duì)2-APB的敏感性顯著上調(diào),表明pCt

7、為2-APB發(fā)揮功能所必需,而dCt則起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
  3)位于C末端近側(cè)區(qū)的368位組氨酸為2-APB的結(jié)合所必需。
  為進(jìn)一步尋找2-APB作用的關(guān)鍵氨基酸,我們將TREK-2 pCt區(qū)內(nèi)相對(duì)于TREK-1的非保守氨基酸(共7個(gè))突變成TREK-1相應(yīng)的氨基酸,并檢測(cè)它們對(duì)2-APB的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有H368Y表現(xiàn)為敏感性下調(diào),表明第368位組氨酸在2-APB開放TREK-2的過程中發(fā)揮了必不可少的作用。為

8、鑒定該氨基酸涉及2-APB的結(jié)合還是通道的門控過程(即門控的公共元件),我們檢測(cè)了H368Y對(duì)胞外pH值(pHo)變化的反應(yīng)。結(jié)果表明,該突變體的行為與野生型相似。已知pHo變化通過引發(fā)外門構(gòu)象變化調(diào)控通道活性,因此該氨基酸并不影響外門的功能,表明該氨基酸可能直接參與2-APB對(duì)TREK-2的結(jié)合。
  4)2-APB通過促進(jìn)TREK-2內(nèi)門開放發(fā)揮其激活通道功能。
  通過改變胞外鉀離子濃度誘導(dǎo)TREK-2通道外門構(gòu)象發(fā)生

9、變化,并不影響2-APB的激活功能。另一方面,TREK-2的S4位點(diǎn)(第四個(gè)鉀離子結(jié)合位點(diǎn),位于外門的最內(nèi)側(cè))突變體T172S和T281S對(duì)2-APB的敏感性也與野生型的相似。這些結(jié)果說明改變TREK-2的外門構(gòu)象并不影響2-APB對(duì)TREK-2通道的開放,提示2-APB的作用與外門構(gòu)象無關(guān)。第四跨膜區(qū)(M4)的甘氨酸鉸鏈突變體(G312A)對(duì)2-APB的敏感性顯著下調(diào),而M4為內(nèi)門的組成分,表明2-APB通過作用于內(nèi)門激活TREK-2

10、通道。
 ?。ǘ㏕REK-2的門控機(jī)制特點(diǎn)探索
  1)在甘氨酸鉸鏈水平,兩個(gè)亞基在TREK-2內(nèi)門開放過程中呈協(xié)同合作(cooperative)方式。
  為鑒定組成成熟TREK-2通道的兩個(gè)亞基在2-APB誘導(dǎo)的內(nèi)門開放過程中呈獨(dú)立或者合作方式,我們構(gòu)建了含有所有可能甘氨酸鉸鏈突變組合的串聯(lián)二聚體(含有兩個(gè)M2甘氨酸鉸鏈突變的除外,因?yàn)闆]有功能性通道表達(dá)),并檢測(cè)它們對(duì)2-APB的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單亞基突變體(

11、共6種)對(duì)2-APB的敏感性與野生型串聯(lián)分子(WT-WT)相似;雙亞基突變體(共5種)對(duì)2-APB的敏感性下調(diào)。這些結(jié)果表明在甘氨酸鉸鏈介導(dǎo)的內(nèi)門活動(dòng)中,兩個(gè)亞基間并不是完全獨(dú)立的,野生型亞基可完全補(bǔ)償突變型亞基的功能,提示兩個(gè)亞基間存在相互協(xié)同合作的關(guān)系。
  2)外門構(gòu)象的變化依賴甘氨酸鉸鏈的活動(dòng)。
  為確定外門構(gòu)象變化是否與甘氨酸鉸鏈活動(dòng)相偶聯(lián),我們檢測(cè)了上述甘氨酸突變體對(duì)pHo變化的反應(yīng)。結(jié)果表明,與對(duì)2-APB的

12、反應(yīng)極為相似:單亞基突變體對(duì)pHo的反應(yīng)與野生型相當(dāng);而雙亞基突變體中,除了G196A-G312A和G312A-G196A與野生型沒有明顯區(qū)別(對(duì)2-APB的反應(yīng)也只與野生型有輕微差別),其它的均表現(xiàn)為敏感性顯著下降。這些結(jié)果提示pHo引起的外門構(gòu)象變化過程中,甘氨酸鉸鏈介導(dǎo)的內(nèi)門活動(dòng)控制著外門活動(dòng),同時(shí)亞基間仍然相互合作。
  3)C末端近側(cè)區(qū)參與對(duì)離子選擇器構(gòu)象的調(diào)控。
  根據(jù)以上結(jié)果,C末端近側(cè)區(qū)與2-APB對(duì)TRE

13、K-2的結(jié)合密切相關(guān),由于該區(qū)段在其它鉀通道中通常為多種信號(hào)整合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,我們也檢測(cè)了該區(qū)段在TREK-2其它門控模型中的可能調(diào)控作用。首先,該區(qū)段缺失體表現(xiàn)為對(duì)2-APB的敏感性顯著下調(diào),與預(yù)期相符。另外,ΔpCt對(duì)pHo的敏感性也表現(xiàn)為顯著降低,提示C末端近側(cè)區(qū)也參與對(duì)離子選擇器構(gòu)象的調(diào)控,同時(shí)表明該區(qū)段為內(nèi)門和離子選擇器的公共調(diào)控元件。
  4)C末端以亞基協(xié)同和順式的方式調(diào)控TREK-2的內(nèi)門和外門。
  綜上所

14、述,C末端在TREK-2的整個(gè)門控機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用,但其調(diào)控的模式未知。為解決這個(gè)問題,我們首先構(gòu)建了單亞基C末端缺失體(串聯(lián)二聚體WT-ΔCt和ΔCt-WT),并檢測(cè)它們對(duì)2-APB和pHo的反應(yīng)。結(jié)果表明,只保留一個(gè)亞基的C末端并不影響TREK-2對(duì)2-APB和pHo的敏感性,提示C末端對(duì)內(nèi)門和離子選擇器的調(diào)控為亞基協(xié)同方式。其次,進(jìn)一步突變上述串聯(lián)二聚體中野生型分子的甘氨酸鉸鏈(ΔCt-G196AG312A)引起對(duì)2-APB

15、和pHo的敏感性顯著下調(diào),表明位于不同亞基上的正常的C末端和甘氨酸鉸鏈的功能并不能相互補(bǔ)償,提示C末端調(diào)節(jié)內(nèi)門和離子選擇器的方式為順式機(jī)制。
  5)內(nèi)門活動(dòng)調(diào)控離子選擇器構(gòu)象的變化。
  總結(jié)以上數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)在涉及甘氨酸鉸鏈和C末端的突變體中,對(duì)2-APB不敏感的也表現(xiàn)為對(duì)pHo不敏感,反之亦然。既然甘氨酸鉸鏈和C末端近側(cè)區(qū)為控制內(nèi)門活動(dòng)的關(guān)鍵元件,同時(shí)根據(jù)TREK-2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),我們認(rèn)為,在TREK-2的門控過程中,內(nèi)

16、門起主導(dǎo)作用,離子選擇器構(gòu)象變化完全受控于內(nèi)門。
  二、選擇性翻譯起始(alternative translational initiation,ATI)產(chǎn)生的三個(gè)TREK-2亞型擁有相似的離子選擇器構(gòu)象
  已知Ba2+為檢測(cè)離子選擇器構(gòu)象變化的有效工具。由于離子選擇器序列在大多數(shù)鉀通道中保守,我們檢測(cè)了TREK-2對(duì)Ba2+的敏感性。
  研究結(jié)論:
  (1)本研究以同源性較高的TREK-1和TREK-2

17、通道對(duì)2-APB的敏感相差懸殊為線索,對(duì)該化合物刺激TREK-2活性的機(jī)制以及TREK-2的門控特點(diǎn)進(jìn)行了探討。首先,我們發(fā)現(xiàn)該化合物主要通過與位于C末端近側(cè)區(qū)的第368位組氨酸結(jié)合,并促進(jìn)內(nèi)門的開放而發(fā)揮其激活活性。隨后,我們以2-APB和pHo分別作為研究?jī)?nèi)門和外門活動(dòng)的工具,發(fā)現(xiàn)甘氨酸鉸鏈和C末端(尤其是近側(cè)區(qū))為控制內(nèi)門和離子選擇器活動(dòng)的重要元件,通道的兩個(gè)亞基在門控過程中相互協(xié)同,而C末端和甘氨酸鉸鏈以順式方式(即位于同一個(gè)亞

18、基的兩種元件)相互調(diào)控。在TREK-2的門控過程中,內(nèi)門處于主導(dǎo)地位,外門構(gòu)象的變化完全依賴內(nèi)門的活動(dòng)。
  (2)Ba2+通過與鉀離子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于位于離子選擇器內(nèi)的第四個(gè)鉀離子結(jié)合位點(diǎn)而抑制TREK-2通道的開放。以Ba2+和pHo為工具,我們發(fā)現(xiàn)由選擇性翻譯起始機(jī)制產(chǎn)生的三種亞型擁有相似的離子選擇器構(gòu)象。
  我們的研究進(jìn)一步豐富了雙孔鉀通道的門控機(jī)制內(nèi)容,可為相關(guān)靶標(biāo)的藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)提供理論指導(dǎo)。同時(shí),2-APB、Ba2

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