匹羅卡品癲癇模型中大鼠海馬和內(nèi)嗅皮層區(qū)TREK-2鉀通道的表達(dá)變化及意義.pdf

1、癲癇（Epilepsy）是世界上最古老的疾病之一，希臘名醫(yī)希波克拉底早在公元前5世紀(jì)就首次記錄過癲癇的發(fā)作。它是一種由于大腦神經(jīng)元突發(fā)性、反復(fù)性、發(fā)作性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的慢性疾病。癲癇現(xiàn)已成為僅次于腦卒中的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾患。臨床常表現(xiàn)為神經(jīng)元反復(fù)放電而引起反復(fù)的驚厥發(fā)作，且具有不可預(yù)見性。目前全球約5000萬癲癇病人，然而手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高且難以根治，藥物治療中將近30％的癲癇患者因抗癲癇藥物無法控制其發(fā)作而發(fā)展為頑固

2、性難治性癲癇，難治性癲癇中有70%為顳葉癲癇。癲癇不僅明顯降低了患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給家庭和社會(huì)增加了嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因而尋求積極有效的治療手段是癲癇研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。
　　雙孔鉀離子通道（Two-pore-domain potassium channels，K2P）是最新發(fā)現(xiàn)的一類鉀離子通道亞型，哺乳動(dòng)物的K2P可分為六類，共包括16個(gè)亞型，其中包括TWIK（弱內(nèi)向整流型雙孔鉀通道）、TASK（酸敏感TWIK相關(guān)雙孔鉀通

3、道）、TREK（TWIK相關(guān)雙孔鉀通道）等亞家族。TREK-2是K2P中最重要的一員，也是K2P中分布最廣表達(dá)最多的亞類，它與TREK-1和TRAAK由于序列結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制的相似同屬TREK一類。TREK-2具有重要的生理和神經(jīng)保護(hù)作用，已經(jīng)有研究證實(shí)TREK-2廣泛表達(dá)于神經(jīng)元并在調(diào)控神經(jīng)元興奮性方面具有重要功能。而癲癇發(fā)病的電生理本質(zhì)就是多種機(jī)制導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制平衡失調(diào)，產(chǎn)生神經(jīng)元過度同步化放電。但是關(guān)于TREK-2在癲癇發(fā)

4、生過程中的時(shí)空表達(dá)變化在國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本課題運(yùn)用鋰鹽-匹羅卡品建立癲癇模型，以TREK-2雙孔鉀通道為研究中心，采用Western-blot、免疫熒光技術(shù)觀察在匹羅卡品癲癇模型中不同時(shí)期TREK-2于癲癇主要好發(fā)部位的表達(dá)特點(diǎn)，并且通過siRNA干擾技術(shù)下調(diào)TREK-2的表達(dá)，進(jìn)一步觀察其對(duì)癲癇發(fā)作的影響。通過證實(shí) TREK-2雙孔鉀通道參與了癲癇的發(fā)生、發(fā)展，力圖為抗癲癇藥物的研制提供新的靶點(diǎn)并為癲癇治療提供新的指

5、導(dǎo)策略。
　　實(shí)驗(yàn)一：匹羅卡品誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性顳葉癲癇大鼠模型的建立
　　目的：觀察匹羅卡品癲癇模型中大鼠的行為學(xué)特點(diǎn)、腦電圖變化和組織形態(tài)學(xué)變化。方法：（1）選用SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重150g~200g。適應(yīng)環(huán)境1周后，大鼠在清醒狀態(tài)下，腹腔注射氯化鋰180mg/kg，18~20h后腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，30min后腹腔注射匹羅卡品30mg/kg，給藥后根據(jù) Racine分級(jí)觀察大鼠行為學(xué)改變。持續(xù)癇性發(fā)作（Raci

6、ne4級(jí)以上)為成功模型，1h后，給予地西泮10mg/kg腹腔注射以終止癲癇發(fā)作，降低死亡率。對(duì)照的正常組大鼠于相同時(shí)間給予同樣劑量的生理鹽水。（2）在大鼠皮層區(qū)埋藏電極，全程了解癲癇發(fā)作前后的EEG動(dòng)態(tài)變化。（3）HE染色觀察模型組大鼠癲癇后不同時(shí)期海馬組織形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：（1）模型組在注射匹羅卡品后動(dòng)物立即有不同程度的膽堿能反應(yīng)，如唾液分泌增多、流淚、腹瀉，15~20min左右，癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為胡須抖動(dòng)，點(diǎn)頭，面部抽搐

7、，前肢和/或尾伸直、僵硬姿勢(shì)，全身性陣攣抽搐，隨后表現(xiàn)為全身性強(qiáng)直陣攣抽搐或伴站立和跌倒。模型組大鼠中89.8%有明顯的癲癇樣發(fā)作，存活率達(dá)75%。正常組大鼠未見癲癇樣發(fā)作。（2）模型組大鼠給予匹羅卡品后EEG均觀察到陣發(fā)性癇性放電，多見高電位的叢集性棘波、尖波、棘尖波。正常組大鼠EEG均表現(xiàn)為基礎(chǔ)波，未觀察到棘波、尖波等癇性波；（3）與正常組相比，模型組大鼠癲癇后不同時(shí)期HE染色發(fā)現(xiàn)海馬各區(qū)有不同程度的神經(jīng)元缺失，CA1和CA3較CA

8、2和DG區(qū)缺失更為明顯。
　　結(jié)論：成功建立癲癇模型，且存活率高，便于之后實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。
　　實(shí)驗(yàn)二：TREK-2在癲癇模型中不同時(shí)期海馬區(qū)與EC區(qū)的表達(dá)變化及其與癲癇發(fā)病的關(guān)系
　　目的：觀察匹羅卡品癲癇模型中不同時(shí)期海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2蛋白的表達(dá)變化，初步探討TREK-2在癲癇發(fā)病過程中的作用。
　　方法：隨機(jī)數(shù)字表將56只成功癲癇模型大鼠于發(fā)作后6h、1d、3d、1w、2w、4w、8w分別迅速斷頭處死后

9、剝離右側(cè)海馬組織和EC區(qū)組織，各時(shí)間點(diǎn)8只，標(biāo)記后置于-80℃冰箱中備Western-blot檢測(cè)TREK-2的表達(dá)，正常組8只采取同樣處理。另外各時(shí)間點(diǎn)另取3只灌注后行免疫熒光染色檢測(cè)，正常組3只采取同樣處理。
　　結(jié)果：（1）在海馬區(qū)，Western-blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組相比，TREK-2在誘導(dǎo)癇性持續(xù)發(fā)作后的3d開始降低（P<0.05），1w，2w，4w明顯降低（P<0.01），8w時(shí)仍維持在很低水平（P<0.00

10、1），免疫熒光結(jié)果顯示了同樣趨勢(shì)。（2）在EC區(qū)，Western-blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組相比，TREK-2在誘導(dǎo)癇性持續(xù)發(fā)作后的1d明顯降低（P<0.001），到2w時(shí)基本恢復(fù)到正常水平（P＞0.05），之后繼續(xù)降低，8w時(shí)降到最低（P<0.001）。免疫熒光結(jié)果顯示了同樣趨勢(shì)。
　　結(jié)論：在癲癇模型中不同時(shí)期，海馬區(qū)與EC區(qū)TREK-2的表達(dá)都不同程度的降低，證實(shí)TREK-2參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程。
　　實(shí)驗(yàn)三：

11、下調(diào)海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2對(duì)匹羅卡品癲癇模型發(fā)作的影響
　　目的：利用TREK-2 siRNA下調(diào)海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2表達(dá)，進(jìn)一步觀察對(duì)大鼠癲癇狀態(tài)的影響。
　　方法：（1）SPF級(jí)雄性SD大鼠在麻醉下（10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射）固定于腦立體定位儀上，按照Paxinos定位海馬位置，然后按坐標(biāo)進(jìn)針。注射位置要在相應(yīng)部位埋套管針灌注后切取腦片確定。實(shí)驗(yàn)共需SD大鼠18只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（sham

12、），溶劑組（no siRNA），亂序RNA組（scr RNA），TREK-2 siRNA-A組（5nM），TREK-2 siRNA-B組（5nM），TREK-2 siRNA-B組（10nM），每組3只。以速度0.5μl/min，劑量2μl進(jìn)行海馬區(qū)微量注射。Sham組只打開皮膚鉆孔但不注射任何藥品。注射72h后取材，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)相應(yīng)海馬組織中TREK-2的表達(dá)變化。(siRNA A序列：5’-UUC UCC GAA

13、CGU GUC ACG UTT-3’，siRNA B序列：5’-TAG GAG GGC GGA AAT ACC AAA-3’)
　?。?）選取最佳干擾效能的TREK-2 siRNA B序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將SD大鼠分為癲癇組和干擾癲癇組，采用上述同樣方法進(jìn)行海馬區(qū)定位注射2μl的溶劑和siRNA B，72h后建立癲癇模型，并對(duì)其行為學(xué)進(jìn)行觀察。其中癲癇1d組5只和干擾組癲癇后1d存活的5只進(jìn)行海馬區(qū)Western-blot取材。EC

14、區(qū)的實(shí)驗(yàn)過程同海馬區(qū)。
　　結(jié)果：（1）通過Western-blot對(duì)TREK-2 siRNA的干擾效能檢測(cè)，結(jié)果顯示正常對(duì)照組、溶劑組、scr RNA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)TREK-2蛋白表達(dá)幾乎沒有影響。與scr RNA組相比，siRNA A可以下調(diào)TREK-2蛋白表達(dá)將近30%（P<0.05），siRNA B可以下調(diào)TREK-2蛋白表達(dá)將近50%以上（P<0.001），且不同濃度（siRNA B5 nM vs siRNA B

15、10 nM）間無明顯差異。因而選擇siRNA B序列作為之后的干擾序列，濃度選用5nM。（2）siRNA干擾TREK-2蛋白表達(dá)后，建立癲癇模型，進(jìn)行行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與癲癇組相比，干擾組癲癇發(fā)作程度明顯增加。與癲癇1d組相比，干擾癲癇1d組TREK-2表達(dá)明顯降低（P<0.01），與siRNA干擾組相比，干擾癲癇1d組TREK-2表達(dá)也明顯降低（P<0.01）。
　　結(jié)論：利用TREK-2 siRNA進(jìn)一步證實(shí)TREK-2參與了癲