機械牽張對雙孔道鉀通道TREK-1基因表達的影響及PKC-MAPK信號通路調(diào)控作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分
　　實驗一 慢性壓力超負荷致心肌肥厚模型的建立及大鼠雙孔道鉀通道TREK-1基因表達的變化
　　目的:探討慢性壓力超負荷致心肌肥厚狀態(tài)下,大鼠心臟雙孔道鉀通道TREK-1基因表達的變化。
　　方法:通過縮窄大鼠腹主動脈4周建立壓力超負荷性心肌肥厚模型(CAA組),并設立正常對照組(Control)和假手術組(Sham)組。觀察期結束后,檢測大鼠血流動力學指標,然后取

2、心臟并分離左右心室,計算左心室濕重/體重(LVW/BW,mg/g)和右心室濕重/體重(RVW/BW,mg/g),分別為左右心室肥厚指數(shù)(LVMI,RVMI);左室心肌HE染色觀察壓力超負荷對心肌組織結構的影響;應用Real-time PCR方法和Western Blots方法檢測左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA及蛋白的表達。
　　結果:CAA組大鼠左室收縮壓(LVSP)、平均動脈壓(MAP)及心率(HR)與對照組相比均存在

3、差異(P<0.01,P<0.05,P<0.05),但左室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力上升最大速度(+dp/dtmax)、左室壓力下降最大速度(-dp/dtmax)無明顯變化;腹主動脈縮窄術后4周,大鼠左心室肥厚指數(shù)較對照組和假手術組明顯增加(P<0.05),光鏡下顯示心肌肥厚;與正常對照組相比,CAA組Real-time PCR和Western Blots結果顯示左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA和蛋白表達均明顯上調(diào)(P<0.

4、05)。
　　結論:腹主動脈縮窄術后4周,可建立壓力超負荷性心肌肥厚模型,此時大鼠心功能仍處于代償期;慢性機械牽張可誘導雙孔道鉀通道TREK-1基因的表達增加,它們在穩(wěn)定心臟機械電反饋的過程中起重要作用。
　　第二部分
　　實驗二 急性機械牽張心臟模型的建立及大鼠雙孔道鉀通道TREK-1基因表達的變化
　　目的:研究大鼠離體灌流心臟受急性機械牽張時,雙孔道鉀通道TREK-1基因的變化。
　　方法:40只雄性

5、SD大鼠隨機分成8組,每組5只,分別行單純Langendorff灌流0min,30min,60min,90min(即L0、L30、L60和L90組)以及急性機械牽張0min,30min,60min,90min(即S0、S30、S60和S90組)。利用Langendorff灌流裝置等建立離體灌流急性機械牽張的心臟模型;應用Real-time PCR方法和Western Blots方法檢測左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA及蛋白的表達

6、。
　　結果:單純行Langendorff灌流各組的雙孔道鉀通道TREK-1的mRNA和蛋白表達無明顯差異(P>0.05);急性牽張0min、30min、60min組TREK-1的表達與相應時間點的單純灌流組比無明顯差異;急性牽張90min組與其他組比較,左室TREK-1mRNA和蛋白的表達明顯增加(P<0.01)。
　　結論:一定時程的急性機械牽張可以上調(diào)離體灌流心臟左室TREK-1基因的表達,它可能在心臟受額外機械牽張時

7、減少心臟心律失常的發(fā)生從而起到保護作用。
　　第三部分
　　實驗一慢性壓力超負荷致心肌肥厚時大鼠心臟PKC活性和MAPK活性的改變及MAPK在心肌細胞內(nèi)分布的變化
　　目的:探討慢性壓力超負荷致心肌肥厚狀態(tài)下,大鼠心臟PKC活性和MAPK活性的變化以及MAPK在心肌細胞內(nèi)分布的改變。
　　方法:通過縮窄大鼠腹主動脈4周建立壓力超負荷性心肌肥厚模型(CAA組),并設立正常對照組(Control)和假手術組(Sham

8、)組。觀察期結束后,取心臟并分離左右心室,計算左心室濕重/體重(LVW/BW,mg/g)和右心室濕重/體重(RVW/BW,mg/g),分別為左右心室肥厚指數(shù)(LVMI,RVMI)。利用(γ-32P)ATP體外標記磷酸化方法進行左室心肌PKC活性測定;采用Western Blots方法檢測左室心肌ERK1/2和p38 MAPK的蛋白含量及其磷酸化蛋白含量,以反映其活化水平;對組織切片進行免疫組織化學染色,觀察左室心肌磷酸化ERK1/2激酶

9、和磷酸化p38 MAPK的細胞內(nèi)分布情況。
　　結果:腹主動脈縮窄術后4周,大鼠左心室肥厚指數(shù)較正常對照組和假手術組明顯增加(P<0.05);與正常對照組相比,CAA組左心室ERK1/2激酶及p38MAPK蛋白總量未見明顯變化(P>0.05);術后4周,大鼠左室PKC活性、ERK1/2激酶活性及p38MAPK活性均增加(P<0.01);正常對照組與假手術組比較,左室PKC活性、ERK1/2激酶活性和p38MAPK活性無明顯差異(P

10、>0.05);免疫組化結果顯示,行腹主動脈縮窄術后,大鼠左室ERK1/2和p38MAPK均發(fā)生明顯活化并伴核轉(zhuǎn)位。
　　結論:慢性壓力超負荷致大鼠心肌肥厚時左室PKC、ERK1/2激酶和p38MAPK活性增加,且活化的ERK1/2激酶和p38MAPK集中于細胞核內(nèi),這提示PKC、MAPK在慢性機械刺激所致的心肌細胞反應中起重要作用,可能參與了慢性機械刺激所致心肌組織中某些基因表達變化的反應過程。
　　第四部分
　　實驗

11、二對大鼠心臟行急性機械牽張時左心室PKC活性和MAPK活性的改變及MAPK在心肌細胞內(nèi)分布的變化
　　目的:研究大鼠離體灌流心臟受急性機械牽張時,大鼠心臟PKC活性和MAPK活性的變化以及MAPK在心肌細胞內(nèi)分布的改變。
　　方法:40只雄性SD大鼠隨機分成8組,每組5只,分別行單純Langendorff灌流0min,30min,60min,90min(即L0、L30、L60和L90組)以及急性機械牽張0min,30min,

12、60min,90min(即S0、S30、S60和S90組)。利用Langendorff灌流裝置等建立離體灌流急性機械牽張的心臟模型;利用(γ-32P)ATP體外標記磷酸化方法進行左室心肌PKC活性測定;采用Western Blots方法檢測左室心肌ERK1/2激酶和p38 MAPK的蛋白含量及其磷酸化蛋白含量,以反映其活化水平;對組織切片進行免疫組織化學染色,觀察左室心肌磷酸化ERK1/2和磷酸化p38 MAPK的細胞內(nèi)分布情況。

13、>　　結果:單純行Langendorff灌流各組PKC活性、ERK1/2活性及p38MAPK活性無明顯差異(P>0.05);與相應對照組相比,急性牽張30min后,PKC活性、ERK1/2激酶活性及p38MAPK活性即開始升高,且ERK1/2和p38MAPK發(fā)生核轉(zhuǎn)位,這些變化持續(xù)此后的機械牽張全過程。
　　結論:急性機械牽張可以增加左室PKC、ERK1/2和p38MAPK活性;心臟PKC、ERK1/2和p38MAPK對急性機械牽

14、張敏感,且活化的ERK1/2和p38MAPK集中于細胞核內(nèi)。這提示PKC、MAPK在急性機械刺激所致的心肌細胞反應中也起重要作用,可能參與了急性機械刺激所致心肌組織中某些基因表達變化的反應過程。
　　第五部分
　　目的:研究PKC-MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在急性機械牽張致大鼠離體灌流心臟雙孔道鉀通道TREK-1基因表達改變中的作用。
　　方法:50只雄性SD大鼠隨機分成5組,即Control組:單純行Langendorff

15、灌流組;Stretch組:急性機械牽張組;Staurosprine組:急性機械牽張+staurosprine(PKC抑制劑)組;U0126組:急性機械牽張+U0126(ERK1/2特異性抑制劑)組;SB202190組:急性機械牽張+SB202190(p38MAPK特異性抑制劑)組。利用Langendorff灌流裝置等建立離體灌流急性機械牽張的心臟模型;采用Western Blots方法檢測左室心肌磷酸化ERK1/2激酶和磷酸化p38 M

16、APK蛋白含量;應用Real-time PCR方法和Western Blots方法檢測左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1mRNA及蛋白的表達。
　　結果:與Control相比,Stretch組左室心肌雙孔道鉀通道TREK-1基因表達明顯增加(P<0.01);灌流液中分別加入PKC抑制劑、ERK1/2抑制劑以及p38MAPK抑制劑后, TREK-1的基因表達與Stretch組比明顯減少。
　　結論:離體灌流心臟受機械刺激時PKC