SPITC試劑結合18O標記進行蛋白質同步定性和定量方法學研究.pdf

1、本文采用磺基異硫氰酸苯酯(SPITC)試劑結合18O標記方法,建立了一種新的能夠同步完成定量和從頭測序的蛋白質組學研究方法。
　　 本研究首先在標準肽(Fibrinopeptide,MW1570Da)中探討了標記步驟的不同對于標記穩(wěn)定性的影響,即先進行SPITC衍生后使用18O標記和先進行18O標記后使用SPITC衍生。研究結果表明標記順序的不同,對于標記穩(wěn)定性沒有明顯影響。標記后肽段的一級圖譜采用基質輔助激光解吸電離質譜(MA

2、LDI-MS)的負離子(Negative ion)模式進行檢測,標記后肽段的二級圖譜采用MALDI-TOF/TOF的LIFT模式進行檢測。通過比較未經(jīng)標記的標準肽和雙標后的標準肽二級圖譜,結果顯示標記后圖譜的碎片峰更為單一,便于圖譜解析。
　　 本文中使用的基質2,4,6-三羥基苯乙酮和檸檬酸氫二銨(THAP/DAC)比在MALDI中的常用基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)更能提高磺化后肽段的響應度,利于進行相關肽段對的定

3、量評估。
　　 本研究分別在一種標準肽和一種標準蛋白中對該方法進行了定量線性相關性地評估。在標準蛋白中,選取以下三個目的肽段,其分子量(負離子模式下)分別為:925Da(完成雙標后的肽段對分子量為1140Da/1144Da),1477Da(完成雙標后的肽段對分子量為1692Da/1696Da),1565Da,(完成雙標后的肽段對分子量為1780Da/1784Da)。定量結果表明,在標準肽中,從0.1到10的動態(tài)范圍之間的定量線性

4、相關性良好,R2值為0.998；在標準蛋白中,10倍動態(tài)范圍內的定量線性相關性亦均表現(xiàn)為良好,R2值均大于0.9。
　　 基于在標準樣品中取得良好的結果,本研究將該方法在基因組未知的蜘蛛毒素樣品中進行了應用,不僅三種蜘蛛毒素的序列測定及定量結果準確,而且還獲得了毒素樣品中含有的未知蛋白/肽段的序列及定量信息。
　　 綜上所述,本研究所采用的試劑均方便易得,價格低廉,無需做進一步處理即可使用,避免了常用途徑中,以合成特定的