SPITC試劑結(jié)合18O標(biāo)記進(jìn)行蛋白質(zhì)同步定性和定量方法學(xué)研究.pdf

1、本文采用磺基異硫氰酸苯酯(SPITC)試劑結(jié)合18O標(biāo)記方法,建立了一種新的能夠同步完成定量和從頭測(cè)序的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。
　　 本研究首先在標(biāo)準(zhǔn)肽(Fibrinopeptide,MW1570Da)中探討了標(biāo)記步驟的不同對(duì)于標(biāo)記穩(wěn)定性的影響,即先進(jìn)行SPITC衍生后使用18O標(biāo)記和先進(jìn)行18O標(biāo)記后使用SPITC衍生。研究結(jié)果表明標(biāo)記順序的不同,對(duì)于標(biāo)記穩(wěn)定性沒有明顯影響。標(biāo)記后肽段的一級(jí)圖譜采用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MA

2、LDI-MS)的負(fù)離子(Negative ion)模式進(jìn)行檢測(cè),標(biāo)記后肽段的二級(jí)圖譜采用MALDI-TOF/TOF的LIFT模式進(jìn)行檢測(cè)。通過比較未經(jīng)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)肽和雙標(biāo)后的標(biāo)準(zhǔn)肽二級(jí)圖譜,結(jié)果顯示標(biāo)記后圖譜的碎片峰更為單一,便于圖譜解析。
　　 本文中使用的基質(zhì)2,4,6-三羥基苯乙酮和檸檬酸氫二銨(THAP/DAC)比在MALDI中的常用基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)更能提高磺化后肽段的響應(yīng)度,利于進(jìn)行相關(guān)肽段對(duì)的定

3、量評(píng)估。
　　 本研究分別在一種標(biāo)準(zhǔn)肽和一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白中對(duì)該方法進(jìn)行了定量線性相關(guān)性地評(píng)估。在標(biāo)準(zhǔn)蛋白中,選取以下三個(gè)目的肽段,其分子量(負(fù)離子模式下)分別為:925Da(完成雙標(biāo)后的肽段對(duì)分子量為1140Da/1144Da),1477Da(完成雙標(biāo)后的肽段對(duì)分子量為1692Da/1696Da),1565Da,(完成雙標(biāo)后的肽段對(duì)分子量為1780Da/1784Da)。定量結(jié)果表明,在標(biāo)準(zhǔn)肽中,從0.1到10的動(dòng)態(tài)范圍之間的定量線性

4、相關(guān)性良好,R2值為0.998；在標(biāo)準(zhǔn)蛋白中,10倍動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的定量線性相關(guān)性亦均表現(xiàn)為良好,R2值均大于0.9。
　　 基于在標(biāo)準(zhǔn)樣品中取得良好的結(jié)果,本研究將該方法在基因組未知的蜘蛛毒素樣品中進(jìn)行了應(yīng)用,不僅三種蜘蛛毒素的序列測(cè)定及定量結(jié)果準(zhǔn)確,而且還獲得了毒素樣品中含有的未知蛋白/肽段的序列及定量信息。
　　 綜上所述,本研究所采用的試劑均方便易得,價(jià)格低廉,無需做進(jìn)一步處理即可使用,避免了常用途徑中,以合成特定的