應(yīng)用非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選基質(zhì)小泡礦化相關(guān)蛋白.pdf

1、在骨形成和發(fā)生過程中，成骨細胞和軟骨細胞通過分泌具有礦化能力的基質(zhì)小泡(MVs)促使細胞外基質(zhì)發(fā)生鈣化。MVs是一種亞顯微結(jié)構(gòu)的(30-400nm)，細胞外的，膜包被的，并且富含鈣離子和磷酸根離子的小囊泡。MVs起源于細胞內(nèi)囊泡。細胞內(nèi)的囊泡運載了來自線粒體的大量鈣離子，并與其內(nèi)的磷酸根離子作用生成無定形磷酸鈣。這種運載了無定形磷酸鈣的小泡被釋放至細胞外沉積于膠原纖維中后，就成為“基質(zhì)小泡”。細胞外基質(zhì)中的MVs繼續(xù)吸收細胞外鈣離子和酶

2、解產(chǎn)生磷酸根離子，將不成熟的無定形磷酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓牧u基磷灰石晶體(HA)。當(dāng)MVs內(nèi)充滿HA后，針狀的HA晶體便會刺破MVs的膜，最后沉積于細胞外基質(zhì)中啟動礦化。
　　 MVs在生物礦化啟動過程中發(fā)揮重要作用，主要包括:提供羥基磷灰石成核位點啟動生物礦化，調(diào)控細胞內(nèi)外的Pi/PPi比值，調(diào)控細胞內(nèi)外Ca2+和Pi的穩(wěn)態(tài)，與細胞外基質(zhì)蛋白相互作用調(diào)控羥基磷灰石晶體的分布和生長等。MVs的多種功能與其富含的礦化相關(guān)蛋白密不可分。近

3、來，多種礦化能力細胞分泌的MVs的蛋白質(zhì)組學(xué)已有報道，但是還沒有研究對不同礦化階段的MVs的蛋白質(zhì)組學(xué)變化進行比較。
　　 Saos-2細胞屬于人成骨肉瘤細胞，具有和成骨細胞一樣的增殖、分化和礦化能力，并且礦化誘導(dǎo)液能加速其分泌并釋放具有礦化能力的MVs。因此Saos-2細胞是體外研究MVs功能的良好細胞模型。MVs和exosomes的傳統(tǒng)提取方法為超速離心法。近來研究者提出ExoQuickTM試劑可用于有效提取exosomes

4、。因此，我們嘗試用ExoQuickTM試劑提取礦化和未礦化的Saos-2細胞分泌的MVs。提取后的物質(zhì)經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查、標志抗原檢測、堿性磷酸酶(ALP)活性分析以及體外形成羥基磷灰石的能力檢測，確定為基質(zhì)小泡。我們對兩組礦化程度不同的MVs蛋白質(zhì)組學(xué)用非標記定量技術(shù)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)與鈣離子相關(guān)的蛋白在礦化的MVs中高表達，包括19個鈣結(jié)合蛋白(calcium binding proteins)、4個鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(calmodulin

5、binding proteins，CaMBPs)和9個蛋白參與鈣離子信號通路(calcium signaling pathway, CaSP)等。
　　 第一章、Saos-2細胞礦化誘導(dǎo)模型的建立目的:采用抗壞血酸和β-磷酸甘油的礦化誘導(dǎo)液來促進Saos-2細胞成骨分化及礦化，建立細胞礦化模型。
　　 方法:將細胞分正常對照組、礦化誘導(dǎo)組進行培養(yǎng):正常對照組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng);礦化誘導(dǎo)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加50 ug/ml

6、抗壞血酸和7.5mMβ-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。兩組細胞培養(yǎng)第六天進行礦化結(jié)節(jié)定性和定量檢測。
　　 結(jié)果:正常對照組Saos-2細胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下能發(fā)生微弱的礦化，顯微鏡視野中只能找到個別礦化結(jié)節(jié);而經(jīng)誘導(dǎo)處理的Saos-2細胞產(chǎn)生大量的羥基磷灰石。礦化結(jié)節(jié)定量結(jié)果顯示誘導(dǎo)組產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)是正常對照組的6倍左右。
　　 討論:本實驗中經(jīng)礦化誘導(dǎo)的Saos-2細胞較正常培養(yǎng)的Saos-2細胞表現(xiàn)出強的鈣化能力，產(chǎn)

7、生大量羥基磷灰石。說明我們成功構(gòu)建細胞礦化模型，為后續(xù)實驗開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二章、基質(zhì)小泡提取和驗證目的:檢驗ExoQuickTM試劑方法能否有效提取基質(zhì)小泡。
　　 方法:用ExoQuickTM試劑方法提取正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)培養(yǎng)Saos-2細胞的細胞外分泌物。分泌物提取后用電子顯微鏡檢測其形態(tài)，用p-NPP檢測其ALP活性檢測，同時用western blot的方法檢測其表面標志物CD63、CD9和Hsp70表達情況

8、。另外，將提取后的物質(zhì)在礦化緩沖溶液中孵育12h，用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)檢測礦物沉淀的組成，用鈣離子檢測試劑盒檢測提取物在孵育前后的鈣離子的濃度變化。
　　 結(jié)果:采用ExoQuickTM試劑提取正常和誘導(dǎo)Saos-2細胞分泌的物質(zhì)經(jīng)離心后團塊呈乳白色，團塊切片后經(jīng)電子顯微觀察發(fā)現(xiàn)來自兩組細胞的提取物直徑均在30-400nm之間，為膜包被小泡，誘導(dǎo)組的小泡內(nèi)有明顯的高電子密度物質(zhì)且ALP活性明顯高于正常組，兩組小泡均

9、表達CD63、CD9和Hsp70。經(jīng)礦化緩沖液中孵育12小時后，礦化組提取的小泡中的鈣離子濃度較孵育前顯著上升且有統(tǒng)計學(xué)意義，且孵育后小泡-礦物沉淀的紅外光譜圖與HA標準品相似。
　　 討論:根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、表面標志物的檢測和ALP活性情況，數(shù)據(jù)顯示ExoQuickTM試劑提取的物質(zhì)為MVs。Saos-2細胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)液刺激后，細胞外基質(zhì)礦化程度比未誘導(dǎo)刺激的細胞顯著增加，而且分泌的基質(zhì)小泡也具有高的ALP活性和羥基磷灰石晶體沉

10、積。ALP作為MVs和礦化標志蛋白，說明來自誘導(dǎo)組和正常組的基質(zhì)小泡在礦化程度上差異明顯，可以作為礦化不同時期的研究模型。提取后的基質(zhì)小泡在礦化緩沖液中仍能繼續(xù)吸收鈣離子生成羥基磷灰石，說明我們提取操作沒有破壞MVs的完整性。MVs擁有自身的一套特殊蛋白質(zhì)組可以獨立于細胞生成羥基磷灰石的能力。因此，通過研究礦化不同階段的MVs蛋白質(zhì)組變化尋找與礦化相關(guān)的蛋白可以豐富我們對生物礦化的理解。
　　 第三章、MVs非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)

11、分析目的:采用非標記定量技術(shù)比較正常組和誘導(dǎo)組基質(zhì)小泡的蛋白質(zhì)組學(xué)差異變化。
　　 方法:采用最新一代的orbitrap質(zhì)譜(Q-exacitve)采集LC-MS/MS數(shù)據(jù)，然后用Maxquant中的Label free算法是對蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進行非標記定量計算。
　　 結(jié)果:本次實驗共鑒定肽段數(shù)11569個，蛋白質(zhì)數(shù)1961個，其中2次實驗中共同鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)為756個。利用Maxquant軟件并結(jié)合Uniprot人蛋

12、白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)并鑒定了明顯差異蛋白255種（比值大于2），其中186種蛋白上調(diào)，69種蛋白下調(diào)。
　　 結(jié)論:本研究首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)非標記定量技術(shù)對礦化和礦化的基質(zhì)小泡進行差異蛋白質(zhì)學(xué)研究。
　　 第四章、MVs蛋白表達譜的生物信息學(xué)分析及驗證目的:對非標記定量蛋白質(zhì)組結(jié)果進行生物信息學(xué)分析。
　　 方法:通過MAS3.0和STRING9.05軟件分別對差異表達蛋白進行GO分析，信號通路分析和蛋白相互作用分析。

13、選取4個鈣結(jié)合蛋白(GRP94，Calnexin，Calregulin，S100A10)以及ALP進行Western Blot實驗驗證。結(jié)果:表達差異的蛋白經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，礦化的基質(zhì)小泡中與鈣離子相關(guān)的蛋白高表達，其中包括鈣離子結(jié)合蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白和鈣離子信號通路蛋白。Western結(jié)果與非標記定量質(zhì)譜結(jié)果一致，ALP和四個鈣離子結(jié)合蛋白（rp94、Calnexin、Calregulin和S100A10）均在礦化的MVs中高表