載索拉非尼及蘿卜硫素介孔二氧化硅脂質納米粒聯用體外抗腫瘤細胞與腫瘤干細胞作用研究.pdf

1、本課題首先研究索拉菲尼(SO)與蘿卜硫素(SF)單獨及聯合用藥對肝腫瘤細胞和腫瘤干細胞的治療效果，然后制備載SO和SF的脂質雙分子層的介孔二氧化硅納米粒(LMSN)，進一步探討載SO和SF的LMSN單獨及聯合用藥對肝腫瘤細胞HepG2的治療效果。
　　我們首先借助于高效液相色譜技術建立了SO和SF含量測定的方法。實驗結果顯示，SO濃度在12.5～400μg·mL-1范圍內與樣品峰面積A呈良好相關性(r=0.9999)，直線回歸方程

2、:A=10061C-203.8。實驗結果顯示，SF濃度在3.125～200μg·mL-1范圍內與樣品峰面積A呈良好相關性(r=0.9999)，直線回歸方程:A=31321 C+44464。結果顯示，SO與SF方法的線性、精密度、回收率、專屬性均符合要求，可以用于藥物的含量檢測。
　　在溫和堿性條件下，以CTAB陽離子表面活性劑作為模板劑，TEOS作為無機硅源，在80℃介孔合成溫度條件下，制備二維結構相的MCM-41型MSN。使用硅

3、烷偶聯劑AEPTMS對MSN進行表面氨基化修飾，制備得到的Ap-MSN分散性顯著得到改善，孔徑增大至9.97nm，孔容積為0.724cm3/g，并增加了對SF的載藥量。采用乙醇注入法，以DOPC，DOPE，DSPE-PEG2000，膽固醇為油相，制備了粒徑均一、在透射電鏡(TEM)下清晰可見核殼結構的的脂質體(Liposome)，然后將Liposome與載藥MSN共孵育，成功制備了具有脂質雙分子層的載藥納米粒(LMSN)。掃描電鏡(SE

4、M)下觀察MSN形貌，大小圓整，粒徑在90～100nm之間。MSN的TEM圖譜表示介孔結構有序、均一是典型的二維結構相MCM-41型介孔分子篩結構。
　　采用CCK-8法檢測藥物對細胞活性，結果表明SO和SF對HepG2細胞生長的抑制效應呈濃度依賴性。通過比較SO與SF在7種不同摩爾比例，每個比例篩選6種不同濃度，利用協(xié)同指數CI值（CI＞1.1，拮抗;0.9＜CI＜1.1，相加;CI＜0.9，協(xié)同），篩選出對肝癌細胞HepG2的

5、協(xié)同、拮抗及相加比例分別為5∶1、1∶1、10∶1。通過平板克隆形成實驗對不同比例細胞克隆形成情況進行考察，結果表明SO與SF在協(xié)同比例5∶1，SO與SF濃度分別是4、0.8μmol/L時其克隆形成數(14.7±3.08)明顯低于拮抗比例1∶1，SO與SF濃度分別是4、4μmol/L時的克隆形成數(31.33±5.16)，P＜0.01;細胞凋亡實驗結果顯示，SO與SF主要抑制HepG2細胞早期凋亡，在SO與SF在協(xié)同比例5∶1時，SO與

6、SF濃度分別是8、1.6μmol/L時其早期凋亡率（18.9±3.87）％明顯高于拮抗比例1∶1，兩藥濃度分別是8、8μmol/L時的早期凋亡率（4.76±0.06）％。
　　選用人肝腫瘤細胞株HepG2，用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到HepG2-TS。以CD133作為肝腫瘤干細胞特異性表面標記物，經流式細胞儀證實肝腫瘤微球體高表達CD133。采用CCK-8法檢測SO與SF對HepG2-TS的細胞殺傷效果，結果表明∶在相同濃度下，SO

7、與SF對HepG2-TS比對HepG2細胞系的IC50低，實驗結果表明，相比HepG2細胞系而言，HepG2-TS對SO與SF更為敏感;微球體成球率實驗表明:經SO與SF處理后，微球體成球率均比空白組下降，而紫杉醇對照組的微球體成球率高于空白組，上述實驗結果表明:SO與SF對肝腫瘤干細胞殺傷作用更強。我們進一步計算不同比例不同濃度下SO與SF對HepG2-TS的協(xié)同指數CI值，結果表明:SO與SF比例為20∶1時表現為協(xié)同作用(CI＜0

8、.9)，5∶1時表現為相加作用(0.9＜CI＜1.1)。
　　在載藥納米粒體外細胞毒性實驗中，空白材料MSN與LMSN在實驗濃度范圍內對HepG2細胞均無細胞毒性。SF/LMSN比SF的細胞殺傷作用更強，SO/LMSN和SO的細胞殺傷作用相比沒有顯著性差異。在SO/LMSN∶SF/LMSN摩爾比為5∶1時比單獨使用SO/LMSN或SF/LMSN具有更強的殺傷效果。
　　本課題采用模板法成功制備MSN，其粒徑均一、表面形貌圓整

9、、具有清晰有序的二維孔道結構。采用HPLC法分析MSN的載藥量及包封率，結果表明以MSN為納米載藥系統(tǒng)可顯著提高對疏水藥物SO的包封率和載藥量;氨基化改性后可提高SF藥物的載藥量及包封率。課題首次比較SO與SF在不同摩爾比時對HepG2細胞系及HepG2-TS的殺傷效果，實驗結果表明當SO與SF摩爾比為5∶1時對HepG2細胞系具有協(xié)同治療效果，對HepG2-TS具有相加治療效果，目前還未見相關報道。SO/LMSN與SF/LMSN在5∶