鹽酸雙苯氟嗪對缺血-再灌注性腦損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目前，臨床上急性腦卒中的主要治療手段是溶栓，但溶栓后的再灌注往往會加劇腦損傷，因此急需研究和開發(fā)能有效對抗缺血再灌注性腦損傷的藥物。鹽酸雙苯氟嗪是由河北醫(yī)科大學(xué)首創(chuàng)合成的一個新型的桂利嗪類衍生物。本實驗室已通過生理、生化及形態(tài)學(xué)等多種技術(shù)從不同角度證明雙苯氟嗪對缺血/再灌注性腦損傷有明顯的保護作用。但是由于雙苯氟嗪較難溶于水，不方便臨床上腦卒中病人使用。所以我們將其制成鹽酸鹽，增加了其在水中溶解度，使其注射液可直接血管內(nèi)給藥。本研究擬在

2、整體動物水平與細(xì)胞水平建立缺血再灌注腦損傷模型，觀察鹽酸雙苯氟嗪對缺血/再灌注損傷的保護作用，并進一步探討其保護機制。
　　第一部分鹽酸雙苯氟嗪對大鼠局灶性缺血再灌注所致腦損傷的保護作用及機制研究
　　目的：評價鹽酸雙苯氟嗪在大鼠局灶性缺血再灌注所造成的腦損傷中的保護作用及其機制
　　方法：大鼠隨機分為假手術(shù)組，溶劑對照組，鹽酸雙苯氟嗪組2.5μmol/kg組，鹽酸雙苯氟嗪1.3μmol/kg組，鹽酸雙苯氟嗪0.7μm

3、ol/kg，氟桂利嗪(Flu)1.3μmol/kg組。采用線栓法制備大鼠局灶性缺血再灌注模型，各組在缺血再灌注的同時尾靜脈注射給藥，給藥容積為0.2ml/100g。假手術(shù)組只行手術(shù)通路，不插線栓不給藥。缺血2h再灌4h后測定神經(jīng)癥狀、腦含水量、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，采用HE染色法光鏡下觀察組織病理變化，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測AQP-4蛋白的表達，以評價鹽酸雙苯氟嗪對缺血再灌注損傷的保護作用，并探討

4、其可能的機制。
　　結(jié)果：(1)神經(jīng)功能評價結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠未產(chǎn)生神經(jīng)功能損傷，溶劑組大鼠神經(jīng)功能評分為9.50±0.22，有明顯損傷(P＜0.01)。鹽酸雙苯氟嗪大、中劑量組和Flu組與溶劑組相比有明顯下降(P＜0.01)，大鼠神經(jīng)功能評分分別降至6.50±0.96、7.33±0.94和7.66±0.42。(2)腦含水量測定結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后腦組織含水量明顯升高至82.24±0.23％，藥物干預(yù)后，鹽酸雙苯氟嗪各劑

5、量組與Flu組大鼠腦含水量有明顯降低，分別為大劑量組78.96±0.95％、中劑量組79.95±0.47％、小劑量組81.08±0.40和Flu組79.41±0.65％，抗腦水腫效果明顯。(3)血清中SOD活性與MDA含量測定結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后血清中SOD活性明顯下降至24.86±0.86 U/ml，MDA含量明顯升高至6.11±0.05nm/ml，給予鹽酸雙苯氟嗪干預(yù)后，可減輕以上損傷，其中大劑量鹽酸雙苯氟嗪作用最為明顯，SO

6、D活性提高至61.79±1.09 U/ml，MDA含量下降為4.64±0.05 nm/ml。(4)HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞未見明顯病變。溶劑組大鼠缺血側(cè)大腦皮層、紋狀體和海馬區(qū)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，胞體固縮，核濃縮深染，細(xì)胞與周圍組織形成明顯的間隙，出現(xiàn)空泡變性。高中低三個劑量的鹽酸雙苯氟嗪可以劑量依賴性明顯改善上述病變。(5)免疫組化檢測AQP-4蛋白表達結(jié)果顯示，AQP4主要在血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞有陽性表達，表達部

7、位為細(xì)胞膜。假手術(shù)組膠質(zhì)細(xì)胞僅有少量AQP-4的表達，缺血再灌注以后梗死周邊區(qū)域AQP-4的表達則明顯增多。鹽酸雙苯氟嗪大劑量組(4.60±0.31)、鹽酸雙苯氟嗪中劑量組(6.10±0.37)以及Flu組(5.70±0.47)膠質(zhì)細(xì)胞的AQP-4表達與溶劑組相比均有顯著減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論：鹽酸雙苯氟嗪能夠通過清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化及減少梗死周邊區(qū)域AQP-4的表達而減輕腦水腫程度，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　第

8、二部分鹽酸雙苯氟嗪對糖氧剝奪/復(fù)氧所致海馬神經(jīng)元損傷的保護作用及機制研究
　　目的：評價鹽酸雙苯氟嗪在糖氧剝奪/復(fù)氧所致海馬神經(jīng)元損傷中的保護作用以及機制研究
　　方法：體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元，7-8天成熟后，細(xì)胞隨機分為12h-R24h組、14h-R24h組、16h-R24h組、18h-R24h組，通過MTT比色法測定細(xì)胞存活率，確定使用16h-R24h作為糖氧剝奪/復(fù)氧模型。經(jīng)16h-R24h損傷后的細(xì)胞隨機分為空白對照

9、組、溶劑對照組、鹽酸雙苯氟嗪10μmol/L組、鹽酸雙苯氟嗪1μmol/L組、鹽酸雙苯氟嗪0.1μmol/L組和氟桂利嗪(Flu)1μmol/L組。分別測定各組神經(jīng)元細(xì)胞MTT OD值、LDH漏出、胞內(nèi)鈣離子濃度、NO含量、NOS活性、細(xì)胞凋亡率，以評價鹽酸雙苯氟嗪的保護作用并研究其機制。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)不同濃度鹽酸雙苯氟嗪干預(yù)的細(xì)胞，MTT測定的OD值明顯增高，顯示細(xì)胞活性升高，LDH漏出顯著降低，表示細(xì)胞受損程度減小。(2

10、)糖氧剝奪/復(fù)氧可致海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)鈣離子超載，鹽酸雙苯氟嗪可減輕由糖氧剝奪/復(fù)氧所致的海馬神經(jīng)元鈣超載，其中高濃度組(238.50±7.73)與溶劑組(319.40±10.79)相比有顯著性差異(P＜0.01)。(3)糖氧剝奪/復(fù)氧損傷會使細(xì)胞NO含量與NOS活性都明顯升高，不同濃度的鹽酸雙苯氟嗪與Flu能夠不同程度的改善此種損傷變化。(4)原位凋亡實驗結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞可見有少量凋亡細(xì)胞(41.30±1.78)，糖氧剝奪/復(fù)氧