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1、灰飛虱(Laodelphax striatellus)是我國(guó)糧食生產(chǎn)上的重要害蟲,它不僅可以刺吸植株汁液,造成直接危害,同時(shí)還能傳播水稻條紋葉枯病、黑條矮縮病等多種病毒病,造成病害流行。水稻條紋葉枯病是由灰飛虱攜帶的水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的重要病毒病,是灰飛虱造成大規(guī)模危害的主要原因。2000年以來,伴隨著我國(guó)江淮稻區(qū)灰飛虱種群的逐年增長(zhǎng),水稻條紋葉枯病發(fā)生日益嚴(yán)重?;绎w虱防控以化學(xué)藥劑為主,但長(zhǎng)
2、期單一用藥極易導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性;而對(duì)于灰飛虱傳播的水稻條紋病毒,目前仍以“治蟲控病”為主,尚無有效藥劑。
RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近年來研究應(yīng)用的熱點(diǎn),除了應(yīng)用于基因功能研究,還可以通過沉默靶標(biāo)基因干擾特定生命過程,從而達(dá)到致死的效果。因此,篩選具有專一性且高效致死的RNAi靶基因,同時(shí)完善RNAi技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用,將有可能為病蟲害防控開辟新途徑。
本研究主要通過RNA干擾技術(shù)篩選高效灰飛虱干擾致
3、死基因及RSV病毒抑制基因,為培育轉(zhuǎn)基因抗蟲抗病水稻提供前期工作基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
1、首先使用NormFinder、qBasePlus和BestKeeper三個(gè)軟件分析EF、Actin、ARF、GAPDH和β-tubulin5個(gè)內(nèi)參的表達(dá)穩(wěn)定性。NormFinder軟件分析得到基因穩(wěn)定性為EF=Actin>ARF>GAPDH>β-tubulin,qBasePlus軟件分析得到結(jié)果為EF>Actin>ARF>GAPD
4、H>β-tubulin,而BestKeeper軟件分析得到結(jié)果為Actin基因穩(wěn)定性最好,EF基因次之,β-tubulin穩(wěn)定性最差。綜合三個(gè)軟件的分析結(jié)果,灰飛虱EF、Actin基因最為穩(wěn)定,可作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參基因。
2、將dsRNA喂食二齡灰飛虱若蟲,120h后檢測(cè)14個(gè)灰飛虱基因的dsRNA對(duì)飛虱若蟲的致死效果,篩選出幾丁質(zhì)酶、α-微管蛋白、核糖體蛋白L9-B、γ-微管蛋白、泛素綴合酶、β-微管蛋白
5、等6個(gè)具有高致死效果的基因,其處理120h后平均校正死亡率均在50%以上,其中幾丁質(zhì)酶基因dsRNA濃度最低,但致死效果最好,校正死亡率達(dá)到62%,為灰飛虱最優(yōu)干擾致死基因。
3、用3種dsRNA分別喂食攜帶RSV病毒的2齡灰飛虱,96h后利用熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)灰飛虱體內(nèi)RSV病毒的表達(dá)量。結(jié)果表明,RSV病毒基因組中的NSvc4、CP基因表達(dá)量大幅下調(diào)95%以上,RdRp基因下調(diào)幅度為51%~78%。同時(shí),測(cè)定了特
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