褐飛虱Dnmt1和N6amt2的表達和功能分析及甜菜夜蛾RNA干擾致死基因的克隆.pdf

1、褐飛虱（Nilaparvata lugens）是一種單食性昆蟲，只為害水稻，種群繁殖速度快，繁殖量大，是我國及許多東南亞、東北亞國家和地區(qū)水稻生產(chǎn)上的重要害蟲。表觀遺傳修飾可在不改變基因組DNA的情況下調(diào)控生物體多種生命活動。本論文對褐飛虱中2個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及其相關(guān)蛋白基因的cDNA全長進行了克隆，開展了2個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的基因結(jié)構(gòu)和分子進化分析。通過數(shù)據(jù)庫及基因組搜索，研究了不同物種中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶種類的分布情況。本論文的

2、研究對理解褐飛虱DNA甲基化的表觀遺傳修飾具有重要的意義。對近年來給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失的雜食性害蟲——甜菜夜蛾的潛在的RNA干擾致死基因進行克隆，對新害蟲防治手段的研究具有重要的意義。
　　1.褐飛虱Dnmt1、N6amt2及DMAP1的全長克隆
　　克隆得到褐飛虱2個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和1個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白基因即DNA(cytosine-5-)-methyltransferase1(Dnmt1), N6-ade

3、nine-specific DNA methyltrans-ferase2(N6amt2)和DNA methyltransferase1-associated protein(DMAP1)的cDNA全長序列，并對3個基因氨基酸序列的等電點、分子量及蛋白二級結(jié)構(gòu)進行了分析。三條序列的GenBank登錄號分別為KF294265，KF294266，KF294267。
　　2.褐飛虱Dnmt1和N6amt2的基因結(jié)構(gòu)和分子進化分析

4、　　分別從蛋白結(jié)構(gòu)域、序列相似性、基因結(jié)構(gòu)及進化4個方面對褐飛虱的Dnmt1和N6amt2基因進行了分析。對Dnmt1基因的分析表明，褐飛虱與人、小鼠、非洲爪蟾及斑馬魚具有完全相同的結(jié)構(gòu)域。不同物種Dnmt1中的結(jié)構(gòu)域序列具有很高的相似性，褐飛虱與非洲爪蟾和斑馬魚相似性為75％，與意大利蜜蜂和人相似性為74％，表明結(jié)構(gòu)域具有保守的重要催化活性。不同物種間Dnmt1基因長度相差很大，內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及長度也有很大差別。
　　對N

5、6amt2基因的分析表明，不同物種的催化活性結(jié)構(gòu)域中都含有QFW motif和DPPF motif。褐飛虱與意大利蜜蜂、家蠶和豌豆蚜的序列相似性最高，分別為74％、69％和65％。與Dnmt1基因類似，N6amt2基因長度相差也比較大，但其內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及長度差別不大。
　　系統(tǒng)進化分析的結(jié)果表明，褐飛虱的Dnmt1及N6amt2均與昆蟲中的同源基因具有較近的進化距離。分析表明，褐飛虱同哺乳動物及膜翅目昆蟲類似，具有完整的D

6、nmt基因家族，部分昆蟲丟失了Dnmt3，雙翅目昆蟲只有Dnmt2。昆蟲中都含有N6amt2基因。
　　3.褐飛虱不同發(fā)育階段及不同翅型種群Dnmt1和N6amt2的表達分析
　　選取普通種群1至5齡若蟲、長翅型未產(chǎn)卵雌蟲和產(chǎn)卵盛期雌蟲、短翅型未產(chǎn)卵雌蟲和產(chǎn)卵盛期雌蟲及長、短翅型雄蟲共11個樣本進行了分析。結(jié)果表明，Dnmt1和N6amt2的表達量在若蟲階段沒有明顯差異，但兩個基因在成蟲階段表達量差異明顯，達顯著水平。無論是

7、長翅型還是短翅型成蟲，Dnmt1和N6amt2在未產(chǎn)卵雌蟲中表達量均明顯低于處于產(chǎn)卵盛期的雌蟲表達量。兩個基因在未產(chǎn)卵和產(chǎn)卵盛期雌蟲的表達量均高于雄蟲。
　　選取普通種群中不同日齡的長翅型和短翅型雌、雄蟲，對成蟲Dnmt1和N6amt2的表達情況開展了分析。結(jié)果表明，不同翅型和性別的成蟲中兩個基因的表達量大多呈先上升后下降的趨勢，且兩個基因在雌蟲中的表達量均明顯高于雄蟲。這些結(jié)果顯示，DNA甲基化可能參與調(diào)控褐飛虱雌蟲的生殖發(fā)育。

8、
　　利用實驗室長期維護的褐飛虱長翅型和短翅型種群進行進一步分析。結(jié)果表明，兩個翅型種群的若蟲Dnmt1和N6amt2表達量從1齡至5齡均呈下降趨勢;Dnmt1在短翅型種群中表達量高于長翅型種群，而N6amt2在長、短翅型種群中的表達量無明顯差異。
　　4.褐飛虱Dnmt1和N6amt2的RNA干擾分析
　　根據(jù)褐飛虱Dnmt1和N6amt2的序列設(shè)計并合成了dsRNA，利用飼喂法對褐飛虱2齡末若蟲進行RNA干擾實驗，

9、利用qRT-PCR檢測RNA干擾后不同時間點2個基因的表達量變化情況，結(jié)果顯示干擾后Dnmt1的表達量與對照組相比竟然有所升高，尤其是第1、2、10、15天的表達量升高更為明顯，而在第5、7天表達量僅有略微升高;干擾后N6amt2的表達量與對照組相比在第1天明顯升高，但從第2天開始表達量開始持續(xù)下降，直至第10天下降最明顯，約下降了62％。兩個基因的干擾組與對照組相比均未出現(xiàn)表型異常的個體。關(guān)于Dnmt1和N6amt2基因的功能尚需深入

10、研究。
　　5.甜菜夜蛾RNA干擾致死基因的克隆
　　對篩選出的4個甜菜夜蛾潛在的RNA干擾致死基因（arf1，arf2，tubulin1，tubulin2）進行了cDNA克隆。獲得arf2的cDNA全長及arf1、tubulin1和tubulin2的完整CDS序列。4條基因序列已提交至GenBank，登錄號分別為JF915770，JQ653045，JQ653042，JQ653043。對4個基因氨基酸序列的等電點、分子量及蛋