髓系腫瘤患者中TET2基因突變分析及DNA雙加氧酶研究.pdf

1、目的：髓系腫瘤（Myeloid tumor）是一類造血干細(xì)胞起源的骨髓克隆性疾病，是一類惡性血液系統(tǒng)疾病的總稱。其包括有急性髓細(xì)胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML），骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes， MDS），慢性骨髓增殖性腫瘤（ chronic myeloproliferative neoplasms,cMPN）等， cMPN又包括原發(fā)性血小板增多癥（ esse

2、ntial thrombocythemia,ET）、真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemiavera,PV）和原發(fā)性骨髓纖維化（ primary myelofibrosis, PMF）等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)， Ten-eleven translocation-2（TET2）基因，在AML、MDS和cMPN等多種血液系統(tǒng)腫瘤中存在頻繁突變。這些腫瘤患者基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)進(jìn)一步導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄沉默，可能是惡性腫瘤患者中抑癌基因失活最常

3、見(jiàn)的原因。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與 TET蛋白催化的主動(dòng)去甲基化過(guò)程存在一種動(dòng)態(tài)平衡。大量數(shù)據(jù)表明，血液系統(tǒng)惡性腫瘤中存在 DNA甲基化紊亂，除DNMT相關(guān)基因的作用外，TET2基因的突變、功能缺失可能亦與造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)初治髓系腫瘤患者TET2基因突變情況，了解髓系腫瘤患者中 TET2基因的突變率及突變類型，同時(shí)對(duì)髓系腫瘤患者的

4、 TET2 mRNA水平、 TET2蛋白水平以及患者5羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5-hmC）水平進(jìn)行測(cè)定，并分析其與TET2基因突變的相關(guān)性，從而了解髓系腫瘤患者TET2基因突變與TET2基因表達(dá)及蛋白活性之間的關(guān)系，并探討其突變與造血功能調(diào)控異常及髓系腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　方法：選取2015年2月至2016年1月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科門診及住院部就診的初治和緩解后的AML

5、（非APL）、MDS及cMPN患者。其中初治AML患者40例，男性患者23例，女性患者17例，年齡16-70歲，中位年齡40歲；緩解后AML患者16例，年齡18-67歲，中位年齡39歲；MDS患者15例，其中男性患者8例，女性患者7例，年齡20-64歲，中位年齡56歲；MPN患者15例，其中男性患者9例，女性患者6例，年齡35-69歲，中位年齡48歲。同時(shí)篩選17例血液系統(tǒng)非惡性疾病患者作為對(duì)照，男9例，女8例，年齡16-59歲，中位年

6、齡為37歲。應(yīng)用基因測(cè)序及RQ-PCR方法分別檢測(cè)患者骨髓液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞中TET2突變狀態(tài)和 mRNA表達(dá)水平，同時(shí)采用Western Blot方法檢測(cè)TET2蛋白表達(dá)水平以及樣本基因組內(nèi)5-hmC含量的高低。
　　結(jié)果：⑴40例初治AML患者中有7例存在 TET2基因突變，突變率為17.5％（7/40）。依據(jù)患者年齡、性別以及WHO分型進(jìn)行分組。突變組患者中位年齡為34歲（20-69），非突變組患者中位年齡為44歲（16-70），

7、二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.807）。突變組男、女比例為1.33（4/3），非突變組男、女比例為1.35（19/14）,二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.983）。依據(jù)WHO分型，40例AML患者中M2、M4及M5亞型人數(shù)分別為15例、13例和12例；上述三種AML亞型中TET2突變陽(yáng)性人數(shù)分別為3例、2例和2例，突變陰性患者人數(shù)分別為12例、11例和10例，突變患者在WHO分型中的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.879）。依據(jù)NCCN2014指南

8、，可將40例初治AML患者分為預(yù)后良好組、中等組和預(yù)后不良組，人數(shù)分別為10例、24例和6例，其中TET2突變陽(yáng)性人數(shù)分別為2例、5例和0例，突變陰性患者為8例、19例和6例，比較AML患者中TET2突變與未突變患者的預(yù)后分級(jí)，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.485）。對(duì)于初治AML患者予以蒽環(huán)類為主的聯(lián)合化療進(jìn)行誘導(dǎo)緩解治療， TET2基因突變組和非突變組完全緩解（CR）率分別為57.14%和84.85%，二組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.26

9、1）。15例MDS患者，發(fā)現(xiàn)有2例存在TET2基因突變，突變率為13.33%。其中1例患者為MDS-RCMD亞型，另1例患者為MDS-RAEB2型。15例cMPN患者中包括3例MF患者、7例ET患者和5例PV患者。對(duì)上述cMPN患者進(jìn)行TET2基因突變檢測(cè)，僅在1例PV患者樣本中發(fā)現(xiàn)TET2突變。受檢cMPN患者的TET2基因突變率為6.67%。⑵與正常對(duì)照組相比，40例初治 AML病例（0.817±0.09 vs.0.414±0.06

10、9;P<0.01）、MPN病例（0.817±0.09 vs.0.469±0.073;P<0.01）和MDS病例（0.817±0.09 vs.0.320±0.028;P<0.01）mRNA表達(dá)量均明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。16例取得完全緩解的AML患者TET2 mRNA水平與40例初治AML患者相比有所升高（0.769±0.082 vs.0.414±0.069;P<0.01），與對(duì)照組無(wú)明顯差別（0.769±0.082 vs.0.817±0

11、.09;P>0.05）。40例初治AML中7例TET突變陽(yáng)性患者TET2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與突變陰性患者對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.461±0.035 vs.0.405±0.071;P>0.05）。⑶與對(duì)照組相比，初治AML患者TET2蛋白表達(dá)水平（0.837±0.078 vs.0.329±0.034; P<0.01）、MPN患者TET2蛋白表達(dá)水平（0.837±0.078 vs.0.517±0.071; P<0.01）和MDS患者TET2

12、蛋白表達(dá)水平（0.837±0.078 vs.0.269±0.018;P<0.01）均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。16例CR AML患者的 TET2蛋白水平與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差別（0.788±0.079 vs.0.837±0.078;P>0.05）。7例TET2基因突變陽(yáng)性初治 AML患者 TET2蛋白相對(duì)表達(dá)水平（0.310±0.030）與33例突變陰性患者表達(dá)水平（0.334±0.034）對(duì)比，二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40例初治AML

13、患者基因組5-hmC含量為（0.063±0.011）%，15例cMPN患者5-hmC含量為（0.081±0.021）%，15例MDS患者5-hmC含量為（0.013±0.003）%，對(duì)照組5-hmC含量（0.128±0.026）為%。各實(shí)驗(yàn)組5-hmC含量表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。16例CR患者5-hmC濃度水平為（0.094±0.04）%，誘導(dǎo)化療后取得CR的AML患者5-hmC含量高于初治患者。7

14、例TET2基因突變陽(yáng)性初治AML患者5-hmC含量（0.054±0.013）%與突變陰性患者含量（0.065±0.025）%對(duì)比，二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：①TET2基因在AML（非APL）患者、MDS患者和cMPN患者中均檢測(cè)到突變發(fā)生，以 AML的突變發(fā)生率最高。但 MDS患者突變種類最多。②在受檢的髓系腫瘤患者中，TET2 mRNA表達(dá)水平和TET2蛋白含量以及5-hmC濃度均較正常對(duì)照組有所降低。推