RAS基因突變和PHLPP1在髓系白血病中的作用.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩94頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、第一部分:應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析檢測RAS基因突變方法的建立
  目的:RAS基因突變是急性髓系白血病中最常見的基因突變之一,本研究擬利用LightScanner平臺建立高分辨熔解曲線分析檢測NRAS和KRAS基因各熱變區(qū)突變的方法,評價該方法的靈敏度,特異性及可靠性。
  方法:分別設(shè)計擴增NRAS和KRAS基因各熱變區(qū)的HRM引物和測序引物,應(yīng)用HRM引物進行PCR擴增,行HRM分析,陽性標(biāo)本進一步應(yīng)用測序引物PCR擴

2、增后測序驗證,同時應(yīng)用野生型克隆對突變型克隆進行不同程度稀釋后進行檢測,評價HRM方法的靈敏度。
  結(jié)果:NRAS和KRAS基因雜合子突變的熔解曲線和熔解峰與野生型明顯不同,通過峰型的改變可以很容易識別雜合子突變。NRAS和KRAS基因純合子突變的熔解曲線峰型與野生型相似,但熔解峰出現(xiàn)可辨識的漂移。HRM分析陽性標(biāo)本均經(jīng)DNA測序證實。
  結(jié)論:利用LightScanner平臺成功建立了HRM篩查NRAS和KRAS基因突

3、變的方法,該方法具有快速,高通量,靈敏度高的特點,可用于白血病患者的臨床檢測。
  第二部分:急性髓系白血病RAS基因突變分析
  目的:應(yīng)用高分辨熔解曲線分析(HRM)及 DNA直接測序法檢測504例中國AML患者的NRAS和KRAS基因所有熱變區(qū)的突變狀態(tài),分析其在中國AML患者的突變率,突變譜,以及與AML臨床特征的關(guān)系。
  方法:收集504例急性髓系白血病患者的初診骨髓液,分離骨髓單個核細胞并提取基因組DNA

4、,設(shè)計擴增NRAS和KRAS基因熱變區(qū):密碼子12,13,和61的HRM引物,分別進行PCR擴增,將PCR產(chǎn)物進行HRM分析篩選突變標(biāo)本。將陽性標(biāo)本進一步PCR擴增行DNA測序驗證。了解RAS基因突變在中國AML患者中的突變率和突變譜,比較RAS基因突變陽性和陰性患者之間骨髓細胞形態(tài)學(xué),遺傳學(xué)及臨床資料的差異,分析RAS基因突變在AML患者中的預(yù)后意義。
  結(jié)果:
  1.在504例中國成人AML患者中,61(12%)名患

5、者伴有RAS基因雜合突變,無純合突變。其中NRAS和KRAS突變率分別為9.7%(49/504)和2.9%(15/504)。
  2.DNA測序顯示,c.35G>A(rs121913237: G>A; p.Gly12Asp和 rs121913529:G>A; p.Gly12Asp)和 c.38G>A(rs121434596: G>A; p.Gly13Asp和 rs112445441:G>A;p.Gly13Asp)是最常見的堿基置換

6、類型,導(dǎo)致甘氨酸被替換成天冬酰胺。
  3.伴RAS基因突變的AML患者外周血白細胞計數(shù)明顯高于無RAS基因突變的患者,在去除預(yù)后良好核型組后進行比較,兩組差異仍具有顯著性(P<0.05)。在中位年齡,性別比例,中位外周血血紅蛋白濃度及血小板計數(shù)上,兩組之間無顯著性差異。
  4.RAS基因在FAB亞型M4和M5中的突變率(分別為21.6%和20.6%)明顯高于其他亞型(7.5%,P=0.006和0.005)。相反的,RAS

7、基因突變少見于M3型(2.5%, P=0.004)。
  5.RAS基因突變在不同預(yù)后核型組間的分布具有顯著性差異(P=0.02)。在伴有11q23異?;騣nv(16)的患者中,RAS基因突變率明顯高于總體的RAS基因突變率(分別是50%和66.6%,P=0.002和0.04)。
  6.FLT3-ITD在伴有RAS基因突變患者中的發(fā)生率明顯低于在無RAS基因突變的患者中的發(fā)生率(5%和15%,P=0.03)。NPM1基因突

8、變與RAS基因突變無相關(guān)性。
  7.無論是在總體AML患者中,還是在各種不同的預(yù)后分組及單核細胞白血病組中,RAS基因突變不影響患者的總生存。在正常核型組進行多因素分析顯示,僅年齡和FLT3-ITD為獨立預(yù)后因素。
  結(jié)論:RAS基因在中國 AML患者中的突變率和突變譜與西方人群相似,RAS基因突變與特定生物學(xué)特征的AML亞群相關(guān),但是對患者總生存無影響。
  第三部分:PHLPP1在慢性髓細胞白血病中的作用

9、>  目的:研究PHLPP1對慢性髓細胞白血病(CML)細胞株K562細胞增殖,細胞周期及細胞凋亡等細胞生物學(xué)的影響及PHLPP1在CML原代細胞中的表達。
  方法:QRT-PCR和 Western-blotting檢測急性髓系白血病細胞株 THP1,HL-60和慢性髓細胞白血病細胞株 K562,Meg01以及原代細胞中 PHLPP1的表達;應(yīng)用Lipofectamine2000將真核過表達載體PCDNA3.0-PHLPP1轉(zhuǎn)染

10、K562細胞,建立過表達PHLPP1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株K562-PHLPP1;臺盼藍拒染法繪制細胞生長曲線;流式細胞儀檢測細胞周期,細胞凋亡;定量PCR檢測慢性髓細胞白血病原代細胞中miR190的表達。
  結(jié)果:
  1.QRT-PCR及Western-blotting顯示慢性髓細胞白血病細胞株K562,Meg01較急性髓系白血病細胞株THP1,HL-60中PHLPP1表達水平明顯下調(diào)(P<0.01)。
  2.QRT

11、-PCR及 Western-blotting鑒定過表達 PHLPP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株顯示, K562-PHLPP1細胞株內(nèi) PHLPP1水平較轉(zhuǎn)染對照細胞株 K562-control顯著升高(P<0.01),表明建株成功。
  3.過表達PHLPP1的K562細胞增殖速度較K562轉(zhuǎn)染對照細胞減慢,培養(yǎng)48小時后兩者細胞計數(shù)具有顯著性差異(p<0.05)。
  4.過表達PHLPP1的K562細胞細胞周期G1/S比例(0.69

12、5±0.026)明顯高于K562轉(zhuǎn)染對照細胞(0.416±0.019)(P<0.05)。在血清饑餓狀態(tài)下結(jié)果相似。
  5.僅僅過表達PHLPP1不足以誘發(fā)K562細胞凋亡,但能明顯增強伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細胞凋亡。應(yīng)用1.0μM伊馬替尼作用于K562-PHLPP1及K562-control細胞,分別在作用0h,24h,48h,72h檢測細胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)兩組細胞早期凋亡率均隨作用時間延長而增高,在伊馬替尼作用48小時后,K562

13、-PHLPP1細胞早期凋亡率明顯高于K562-control細胞(P<0.05)。
  6.經(jīng)2.0μM伊馬替尼作用于K562細胞0h,12h,24h,36h,細胞內(nèi)PHLPP1蛋白水平在12h即明顯升高(P<0.05),36h達到最高(P<0.01)。
  7.QRT-PCR顯示,CML原代細胞內(nèi) PHLPP1平均水平與 K562細胞株一致(P>0.05),較急性髓系白血病細胞株THP1明顯減低(P<0.01)。Weste

14、rn-blotting結(jié)果與QRT-PCR結(jié)果相符。
  8.CML原代細胞內(nèi) miR190表達水平與 PHLPP1表達水平無相關(guān)性(r=-0.07, P=0.78)。
  結(jié)論:
  1.PHLPP1在CML細胞株K562中低表達,過表達PHLPP1可通過阻滯K562細胞周期于G1期抑制細胞增殖;
  2.僅僅過表達PHLPP1不足以誘發(fā)K562細胞凋亡,但明顯增強伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細胞凋亡,伊馬替尼能上調(diào)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論