RAS基因突變和PHLPP1在髓系白血病中的作用.pdf

1、第一部分：應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析檢測RAS基因突變方法的建立
　　目的：RAS基因突變是急性髓系白血病中最常見的基因突變之一，本研究擬利用LightScanner平臺建立高分辨熔解曲線分析檢測NRAS和KRAS基因各熱變區(qū)突變的方法，評價該方法的靈敏度，特異性及可靠性。
　　方法：分別設(shè)計擴(kuò)增NRAS和KRAS基因各熱變區(qū)的HRM引物和測序引物，應(yīng)用HRM引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，行HRM分析，陽性標(biāo)本進(jìn)一步應(yīng)用測序引物PCR擴(kuò)

2、增后測序驗證，同時應(yīng)用野生型克隆對突變型克隆進(jìn)行不同程度稀釋后進(jìn)行檢測，評價HRM方法的靈敏度。
　　結(jié)果：NRAS和KRAS基因雜合子突變的熔解曲線和熔解峰與野生型明顯不同，通過峰型的改變可以很容易識別雜合子突變。NRAS和KRAS基因純合子突變的熔解曲線峰型與野生型相似，但熔解峰出現(xiàn)可辨識的漂移。HRM分析陽性標(biāo)本均經(jīng)DNA測序證實(shí)。
　　結(jié)論：利用LightScanner平臺成功建立了HRM篩查NRAS和KRAS基因突

3、變的方法，該方法具有快速，高通量，靈敏度高的特點(diǎn)，可用于白血病患者的臨床檢測。
　　第二部分：急性髓系白血病RAS基因突變分析
　　目的：應(yīng)用高分辨熔解曲線分析（HRM）及 DNA直接測序法檢測504例中國AML患者的NRAS和KRAS基因所有熱變區(qū)的突變狀態(tài)，分析其在中國AML患者的突變率，突變譜，以及與AML臨床特征的關(guān)系。
　　方法：收集504例急性髓系白血病患者的初診骨髓液，分離骨髓單個核細(xì)胞并提取基因組DNA

4、，設(shè)計擴(kuò)增NRAS和KRAS基因熱變區(qū)：密碼子12，13，和61的HRM引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析篩選突變標(biāo)本。將陽性標(biāo)本進(jìn)一步PCR擴(kuò)增行DNA測序驗證。了解RAS基因突變在中國AML患者中的突變率和突變譜，比較RAS基因突變陽性和陰性患者之間骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)，遺傳學(xué)及臨床資料的差異，分析RAS基因突變在AML患者中的預(yù)后意義。
　　結(jié)果：
　　1.在504例中國成人AML患者中，61（12%）名患

5、者伴有RAS基因雜合突變，無純合突變。其中NRAS和KRAS突變率分別為9.7%（49/504）和2.9%（15/504）。
　　2.DNA測序顯示，c.35G>A(rs121913237: G>A; p.Gly12Asp和 rs121913529:G>A; p.Gly12Asp)和 c.38G>A(rs121434596: G>A; p.Gly13Asp和 rs112445441:G>A;p.Gly13Asp)是最常見的堿基置換

6、類型，導(dǎo)致甘氨酸被替換成天冬酰胺。
　　3.伴RAS基因突變的AML患者外周血白細(xì)胞計數(shù)明顯高于無RAS基因突變的患者，在去除預(yù)后良好核型組后進(jìn)行比較，兩組差異仍具有顯著性（P<0.05）。在中位年齡，性別比例，中位外周血血紅蛋白濃度及血小板計數(shù)上，兩組之間無顯著性差異。
　　4.RAS基因在FAB亞型M4和M5中的突變率（分別為21.6%和20.6%）明顯高于其他亞型（7.5%，P=0.006和0.005）。相反的，RAS

7、基因突變少見于M3型（2.5%， P=0.004）。
　　5.RAS基因突變在不同預(yù)后核型組間的分布具有顯著性差異（P=0.02）。在伴有11q23異?；騣nv(16)的患者中，RAS基因突變率明顯高于總體的RAS基因突變率（分別是50%和66.6%，P=0.002和0.04）。
　　6.FLT3-ITD在伴有RAS基因突變患者中的發(fā)生率明顯低于在無RAS基因突變的患者中的發(fā)生率（5%和15%，P=0.03）。NPM1基因突

8、變與RAS基因突變無相關(guān)性。
　　7.無論是在總體AML患者中，還是在各種不同的預(yù)后分組及單核細(xì)胞白血病組中，RAS基因突變不影響患者的總生存。在正常核型組進(jìn)行多因素分析顯示，僅年齡和FLT3-ITD為獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)論：RAS基因在中國 AML患者中的突變率和突變譜與西方人群相似，RAS基因突變與特定生物學(xué)特征的AML亞群相關(guān)，但是對患者總生存無影響。
　　第三部分：PHLPP1在慢性髓細(xì)胞白血病中的作用

9、>　　目的：研究PHLPP1對慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)的影響及PHLPP1在CML原代細(xì)胞中的表達(dá)。
　　方法：QRT-PCR和 Western-blotting檢測急性髓系白血病細(xì)胞株 THP1，HL-60和慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株 K562，Meg01以及原代細(xì)胞中 PHLPP1的表達(dá)；應(yīng)用Lipofectamine2000將真核過表達(dá)載體PCDNA3.0-PHLPP1轉(zhuǎn)染

10、K562細(xì)胞，建立過表達(dá)PHLPP1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株K562-PHLPP1;臺盼藍(lán)拒染法繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡；定量PCR檢測慢性髓細(xì)胞白血病原代細(xì)胞中miR190的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.QRT-PCR及Western-blotting顯示慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562，Meg01較急性髓系白血病細(xì)胞株THP1，HL-60中PHLPP1表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.01）。
　　2.QRT

11、-PCR及 Western-blotting鑒定過表達(dá) PHLPP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株顯示， K562-PHLPP1細(xì)胞株內(nèi) PHLPP1水平較轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞株 K562-control顯著升高（P<0.01），表明建株成功。
　　3.過表達(dá)PHLPP1的K562細(xì)胞增殖速度較K562轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞減慢，培養(yǎng)48小時后兩者細(xì)胞計數(shù)具有顯著性差異（p<0.05）。
　　4.過表達(dá)PHLPP1的K562細(xì)胞細(xì)胞周期G1/S比例（0.69

12、5±0.026）明顯高于K562轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞（0.416±0.019）（P<0.05）。在血清饑餓狀態(tài)下結(jié)果相似。
　　5.僅僅過表達(dá)PHLPP1不足以誘發(fā)K562細(xì)胞凋亡，但能明顯增強(qiáng)伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡。應(yīng)用1.0μM伊馬替尼作用于K562-PHLPP1及K562-control細(xì)胞，分別在作用0h，24h，48h，72h檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞早期凋亡率均隨作用時間延長而增高，在伊馬替尼作用48小時后，K562

13、-PHLPP1細(xì)胞早期凋亡率明顯高于K562-control細(xì)胞（P<0.05）。
　　6.經(jīng)2.0μM伊馬替尼作用于K562細(xì)胞0h，12h，24h，36h，細(xì)胞內(nèi)PHLPP1蛋白水平在12h即明顯升高（P<0.05），36h達(dá)到最高（P<0.01）。
　　7.QRT-PCR顯示,CML原代細(xì)胞內(nèi) PHLPP1平均水平與 K562細(xì)胞株一致（P>0.05），較急性髓系白血病細(xì)胞株THP1明顯減低（P<0.01）。Weste

14、rn-blotting結(jié)果與QRT-PCR結(jié)果相符。
　　8.CML原代細(xì)胞內(nèi) miR190表達(dá)水平與 PHLPP1表達(dá)水平無相關(guān)性(r=－0.07, P=0.78)。
　　結(jié)論：
　　1.PHLPP1在CML細(xì)胞株K562中低表達(dá)，過表達(dá)PHLPP1可通過阻滯K562細(xì)胞周期于G1期抑制細(xì)胞增殖；
　　2.僅僅過表達(dá)PHLPP1不足以誘發(fā)K562細(xì)胞凋亡，但明顯增強(qiáng)伊馬替尼誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡，伊馬替尼能上調(diào)