產(chǎn)木質(zhì)素降解酶真菌的分離及其發(fā)酵條件的研究.pdf

1、木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元分子之間通過穩(wěn)定的化學(xué)鍵形成的復(fù)雜芳香族高分子化合物，由于其立體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所以很難被水解。自然界中能降解木質(zhì)素的微生物主要有細(xì)菌、放線菌和真菌。其中真菌起著主要作用。真菌參與木質(zhì)素的降解作用酶主要是木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，它們都是菌體分泌的胞外氧化酶。這些氧化酶對多種污染物都表現(xiàn)出了廣譜的降解作用，包括酚類、多環(huán)芳烴、各種染料、五氯聯(lián)苯等難降解物質(zhì)，隨著人類對環(huán)境污染和資源危機(jī)等問題的認(rèn)識不斷深

2、入，從自然環(huán)境中分離可降解污染物的微生物并對它們所產(chǎn)污染物降解酶進(jìn)行研究，是當(dāng)代環(huán)境保護(hù)與經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大課題，也是對當(dāng)代科學(xué)技術(shù)提出的新要求。
　　 本研究從自然界中分離純化一些真菌菌株，研究了這些菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的能力，并對產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行分類鑒定。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，期望獲得木質(zhì)素降解酶酶活力高的發(fā)酵條件。主要結(jié)果如下：
　　 1、木質(zhì)素降解真菌的篩選。采用子實(shí)體組織分離法獲得了14株純菌株。以固體平

3、板上的顯色反應(yīng)為初篩，進(jìn)行快速篩選木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生菌，綜合愈創(chuàng)木酚氧化和苯胺藍(lán)脫色結(jié)果，菌株Ga2、S2和W1在平板上顯色明顯，初步斷定這些菌株有較強(qiáng)的產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力。復(fù)篩過程在液體培養(yǎng)條件下進(jìn)行，對經(jīng)初步篩選有木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生能力的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，測定其木質(zhì)素降解酶活力。
　　 2、產(chǎn)木質(zhì)素降解酶菌株W1的分子鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。提取其總DNA，選用真菌通用引物ITS序列進(jìn)行，進(jìn)行PCR手段克隆擴(kuò)增菌株W1的5.

4、8sRNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)，經(jīng)與GenBank中已有的菌株序列比對，發(fā)現(xiàn)與多株Irpex lacteus序列有較高的相似度，為確定它們間的進(jìn)化關(guān)系，將W1與8株I.lacteus菌序列比對，隨后借助軟件MEGA4.0的鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，由發(fā)育樹可知，W1與I.lacteus XSD-2親緣關(guān)系最近。
　　 3、I.lacteus W1菌株的錳過氧化物酶（MnP）和木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）液體發(fā)酵條

5、件的優(yōu)化。（1）分別采用單因素試驗(yàn)、正交設(shè)計和響應(yīng)曲面法，優(yōu)化I.lacteus W1菌株產(chǎn)MnP培養(yǎng)條件。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示I.lacteus W1產(chǎn)MnP的最佳碳氮源為葡萄糖、酵母粉，培養(yǎng)條件為28℃、pH5.5、120rpm/min。正交設(shè)計指示影響MnP產(chǎn)量的3個主要因素分別為誘導(dǎo)劑Tween 80、酵母粉和葡萄糖。最優(yōu)培養(yǎng)基組合為葡萄糖15g/L，酵母粉0.2g/L，KH2PO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/

6、L，Tween 801g/L。經(jīng)正交設(shè)計優(yōu)化試驗(yàn)MnP產(chǎn)量提高至67.7U/L，增加67％。Plackeet-Burman設(shè)計得出影響MnP產(chǎn)量的3個主效應(yīng)因素為Tween 80、酵母粉和葡萄糖。經(jīng)Box-Beheken design設(shè)計優(yōu)化了3個主效應(yīng)因素，預(yù)測了最佳產(chǎn)MnP的條件為葡萄糖、酵母粉和Tween 80分別為17.67g/L、0.18g/L和1.40g/L。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基上MnP產(chǎn)量為53.8U/L,是原培養(yǎng)條件下的1.