刺芹側(cè)耳木質(zhì)素降解酶的研究.pdf

1、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)隸屬于真菌門、真擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科，側(cè)耳屬，是一種具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的白腐真菌，極具工業(yè)應(yīng)用價值。木質(zhì)素降解酶是參與木質(zhì)素生物降解過程中的酶類，具有高氧化降解能力和多底物性，能夠降解木質(zhì)素、多環(huán)芳烴類化合物、雜環(huán)類化合物和合成染料等多種難降解有機(jī)物。
　　 本研究以刺芹側(cè)耳GIM5.280為研究對象，進(jìn)行了能以2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽

2、(ABTS)和愈創(chuàng)木酚為底物的高產(chǎn)胞外木質(zhì)素降解酶的菌種選育和表達(dá)條件優(yōu)化，并對發(fā)酵液中的木質(zhì)素降解酶分離純化路線、酶學(xué)性質(zhì)、染料和木質(zhì)素磺酸鈉降解效果開展系統(tǒng)研究，為今后將其應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、生物漂白與制漿、食品工業(yè)等領(lǐng)域提供理論和實(shí)踐依據(jù)。
　　 為了選育高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的刺芹側(cè)耳菌株，系統(tǒng)研究了刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體制備及再生體系。采用0.6mol/L(M)甘露醇為酶解滲透壓穩(wěn)定劑，在30℃、pH5.5下，以4％蝸牛酶和2%溶壁酶

3、的復(fù)合酶酶解3天菌齡的刺芹側(cè)耳菌絲體3h，可獲得最大原生質(zhì)體得率，酶解液中原生質(zhì)體數(shù)目可達(dá)1.82×108個/mL。所得原生質(zhì)體經(jīng)0.6M的蔗糖（再生滲透壓穩(wěn)定劑）配制的SYM培養(yǎng)基再生培養(yǎng)，上層瓊脂濃度設(shè)定為0.7%，原生質(zhì)體再生率最高，可達(dá)0.35%。
　　 通過紫外和60Coγ的二次復(fù)合誘變及繼代培養(yǎng)篩選獲得一株搖瓶酶活達(dá)110U/mL，較出發(fā)菌株酶活提高54.3%的穩(wěn)定誘變株，命名為P．eryngiiCo007，用于后續(xù)

4、發(fā)酵及分離純化試驗(yàn)。通過單因素試驗(yàn)和中心組合響應(yīng)面優(yōu)化分析考察了影響PeryngiiCo007菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的因素，得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的最適培養(yǎng)基組成和發(fā)酵參數(shù)。然后在發(fā)酵罐中進(jìn)行了產(chǎn)酶擴(kuò)大試驗(yàn)，在攪拌速度250rpm/min、通風(fēng)量0.6vvm條件下，按最適培養(yǎng)基(3%葡萄糖，0.05%硫酸鎂，0.4%磷酸二氫鉀，0.2%酵母粉，0.2%胰蛋白胨，秸桿1.10%，Cu2+4.01mmol/L，吐溫800.84g/L)和最適

5、發(fā)酵參數(shù)（初始pH5.63，發(fā)酵溫度26℃，接種量15%）進(jìn)行發(fā)酵，木質(zhì)素降解酶酶活最高值出現(xiàn)在第10天，達(dá)到了324.72U/mL。
　　 建立了一條從P． eryngii Co007發(fā)酵液中快速分離純化木質(zhì)素降解酶的技術(shù)路線。通過35%硫酸銨飽和度初沉和75%硫酸銨飽和度二沉，可從P．eryngii Co007發(fā)酵液中去除掉大部分雜蛋白和獲得絕大部分的目標(biāo)蛋白沉淀。經(jīng)DEAE-Sepharose(TM) Fast Flow(

6、DEAE FF)離子交換三步層析，可較好地純化目標(biāo)酶。該路線總純化因子達(dá)10.3，回收率76.2%。經(jīng)SDS-PAGE和Native-PAGE電泳分析，收集到的洗脫液中含有三種木質(zhì)素降解酶，都具有活性。按其分子量大小，將其命名為Peco60-7-ldⅠ、Peco60-7-ldⅡ、Peco60-7-ldⅢ。采用肽指紋圖譜分析方法和N末端測序法對分離純化的三種單一組分進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果證實(shí)Peco60-7-ldⅠ是芳基乙醇酶，Peco60-

7、7-ldⅡ是漆酶，Peco60-7-ldⅢ是多功能過氧化物酶，分別命名為AAO-Peco60-7，Lac-Peco60-7和VP-Peco60-7。
　　 AAO-Peco60-7酶是發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨鹽沉、DEAE FF層析、Sephacryl(TM) S-200 HighResolution層析和SourceTM15Q層析后獲得，該過程的純化倍數(shù)為38.2，得率為25.5%。AAO-Peco60-7分子量約70kDa，等電點(diǎn)為4

8、.2。以ABTS為底物，AAO-Peco60-7酶學(xué)性質(zhì)如下：AAO-Peco60-7最適催化pH為3.0，pH為3.6時該酶穩(wěn)定性最好，24h后殘余酶活高達(dá)88%。AAO-Peco60-7最適催化溫度為70℃，在4℃到60℃的溫度范圍內(nèi)，酶較穩(wěn)定，60℃保溫50min后AAO-Peco60-7殘余酶活還有80%左右，表現(xiàn)出較好的耐熱性。氧化ABTS的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為102.04U/mg和214.96μmol。測試金屬離子

9、沒有促進(jìn)作用，其中的Fe3+、Fe2+、Ag+和Ca2+有明顯抑制作用。
　　 Lac-Peco60-7酶是發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨鹽沉、DEAE FF層析和割膠純化后獲得，其分子量約62kDa，等電點(diǎn)為4.5。以ABTS為底物，Lac-Peco60-7酶學(xué)性質(zhì)如下：Lac-Peco60-7最適催化pH為4.0，pH為4.6時該酶穩(wěn)定性最好，24h后殘余酶活約85%。最適催化溫度為60℃，50℃以下穩(wěn)定性較好，50℃保溫40min后殘余

10、酶活還有40%左右，當(dāng)溫度超過50℃時，酶活損失加劇。氧化ABTS的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為227.27U/mg和252.33μmol。金屬離子中Zn2+和Cu2+對Lac-Peco60-7有明顯促進(jìn)作用，Ag+、Fe2+和Mn2+有明顯的抑制作用。
　　 VP-Peco60-7酶是發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨鹽沉、DEAE FF層析和Sephacryl(TM) S-200 High Resolution凝膠層析后獲得，其純化倍數(shù)為27

11、.0，得率為19.1%。VP.Peco60-7分子量約40kDa，等電點(diǎn)為4.1。以ABTS為底物，VP-Peco60-7酶學(xué)性質(zhì)如下：VP.Peco60-7最適催化反應(yīng)pH為3.0，pH為4.0時該酶穩(wěn)定性最好，24h后殘余酶活約50%。最適催化溫度為50℃，VP-Peco60-7熱穩(wěn)定性差，30℃保溫60min后其殘余酶活力只有52%左右，當(dāng)溫度超過50℃時，酶活損失嚴(yán)重。氧化ABTS的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為188.68U/

12、mg和203.09μmol。金屬離子中Zn2+和Cu2+對VP-Peco60-7有明顯促進(jìn)作用，而Fe3+、Fe2+和Mn2+有明顯的抑制作用。
　　 采用經(jīng)DEAE純化的P．eryngiiCo60-7混合酶液對不同染料進(jìn)行脫色試驗(yàn)，結(jié)果表明混合酶液對三苯甲烷類染料溴酚藍(lán)降解效果最好，24h染液脫色率近99.3%。雙偶氮類染料剛果紅降解效果次之，24h染液脫色率達(dá)53.7%。雜環(huán)類染料亞甲基蘭降解效果最差，24h染料脫色率只有1

13、1.5%。對脫色影響因素進(jìn)行研究，以2h溴酚藍(lán)脫色體系為例，在脫色溫度30℃、pH4.0、H2O25μM、混合酶液濃度20U/mL、染料濃度25μM的條件下，脫色效率最高，達(dá)85.61%。小分子介體物質(zhì)ABTS對溴酚藍(lán)脫色體系脫色率無促進(jìn)。
　　 采用經(jīng)DEAE純化的P．eryngiiCo60-7混合酶液對木質(zhì)素磺酸鈉進(jìn)行了降解試驗(yàn)，結(jié)果表明，降解體系中含有50mMpH4.6乙酸鈉-乙酸緩沖液，100mg/L木質(zhì)素磺酸鈉，1mM