燒傷早期大鼠心肌線粒體比較蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、缺血缺氧是嚴重燒傷早期重要的病理生理現(xiàn)象，而缺血缺氧引發(fā)細胞死亡和組織器官損害的根本原因是能量代謝障礙。心臟是一高耗能的器官，線粒體正常的呼吸功能在維持心臟的正常生理活動中發(fā)揮重要作用。以往研究已證實，在嚴重燒傷或心肌缺血缺氧時，線粒體氧化磷酸化關(guān)鍵酶活性降低、ATP合成不足是誘發(fā)或加重心肌損傷的重要原因，而心臟作為全身血液循環(huán)的動力器官，心肌的損傷和功能減退必將進一步加重全身的缺血缺氧，從而形成惡性循環(huán)。 線粒體能量代謝障礙是

2、多種復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果，尤其是當機體受到燒傷、創(chuàng)傷、應(yīng)激、缺氧等刺激時。以往多研究關(guān)鍵酶在能量代謝障礙中的作用，對能量代謝障礙發(fā)生發(fā)展過程中線粒體的損傷與代償反應(yīng)缺乏整體了解，因此，缺少防治線粒體能量代謝障礙的有效干預(yù)手段。比較蛋白質(zhì)組學為我們提供了全貌性了解心肌線粒體在燒傷早期代謝障礙發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)組的差異表達規(guī)律，以及在此基礎(chǔ)上探索上游分子機制或關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)的手段。 本研究利用大鼠燒傷模型，以比較蛋白質(zhì)組學的方法動

3、態(tài)觀察燒傷早期心肌線粒體蛋白質(zhì)組的表達差異，并初步驗證了關(guān)鍵的差異表達蛋白活性改變可能引起的生物效應(yīng)，有助于了解在應(yīng)激、缺氧等刺激下心肌線粒體的損傷與代償反應(yīng)，尋找在心肌線粒體能量代謝障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的關(guān)鍵蛋白分子，為防治燒傷早期心肌損傷提供新靶點與理論依據(jù)。 材料與方法： 采用動物實驗和體外實驗相結(jié)合的方法 1.以Nycodenz密度梯度離心法獲取大鼠心肌組織純化線粒體，并以透射電鏡、Westernb

4、lot法驗證其純度與完整性； 2.建立大鼠30％TBSAⅢ°燙傷模型，以正常對照組與燒傷各組純化的心肌線粒體裂解蛋白行雙向凝膠電泳(2-DE)、考馬斯亮藍染色、凝膠掃描后獲2-DE圖譜，以PDQuest軟件分析各組差異表達蛋白點，并將各蛋白點切下行膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜分析后獲差異表達蛋白譜： 3.在動物燒傷模型與體外細胞缺氧模型的基礎(chǔ)上，驗證關(guān)鍵差異蛋白的表達趨勢，同時檢測以魚藤酮作用于心肌細胞驗證關(guān)鍵蛋白活性受抑后的生物效應(yīng)

5、，以及心肌線粒體的超微病理損傷。 主要結(jié)果與結(jié)論： 1.采用Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心法提純了大鼠心肌線粒體，并以透射電鏡與Westernblot法證實在不影響線粒體完整性的情況下，提純過程進一步提高了線粒體的純度與富集程度： 2.以正常對照組與燒傷后1、3小時組的心肌線粒體蛋白行雙向電泳，得到聚焦良好、顯色清晰、相似性高的2-DE圖譜，在各組膠上平均有394.7±5.5、391.0±13.9、385.3

6、±12.6個蛋白點，以PDQuest軟件對各組圖譜分析后得到10個差異表達蛋白點，將各點行膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜分析后獲得差異表達蛋白譜； 3.通過分析差異表達蛋白譜，發(fā)現(xiàn)其中8個蛋白在燒傷早期表達下降，分別為：TNF受體相關(guān)蛋白1、甲基丁烯酰輔酶A羧化酶1(α)、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白-泛醌氧化還原酶、NADP+依賴的蘋果酸酶3、NADH脫氫酶(泛醌)黃素蛋白1、線粒體翻譯延伸因子Tu(EF-Tumt)、長鏈乙酰-輔酶A脫氫酶與短鏈乙酰-輔

7、酶A脫氫酶；體現(xiàn)了燒傷后的機體損傷，這些蛋白表達降低可能引起的生物效應(yīng)是ATP合成減少、ROS生成增多、抗氧化能力降低、促進凋亡；另外2個蛋白點表達增高，分別為：推測蛋白LOC498909與ATP合酶F1復(fù)合體α亞單位，其意義可能為抵抗上述各種損傷的內(nèi)源性保護效應(yīng)； 4.在表達下降的蛋白點中我們發(fā)現(xiàn)在功能上有密切關(guān)系的兩個蛋白點，即EF-Tumt與NADH脫氫酶。EF-Tumt為參與NADH脫氫酶蛋白合成的上游因子，而NADH脫

8、氫酶為線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的催化核心，其下降將引起復(fù)合體Ⅰ活性降低，因此，我們推測燒傷后EF-Tumt表達下降可能通過降低NADH脫氫酶的蛋白表達進一步影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性，導致能量代謝障礙； 5.為初步證實這一推測，我們首先回復(fù)驗證了EF-Tumt、NADH脫氫酶亞單位3在各組動物心肌線粒體中的表達變化，證實了2-DE結(jié)果的可靠性；并發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的缺氧心肌細胞中EF-Tumt蛋白表達亦有降低；在體外以魚藤酮阻斷復(fù)合體Ⅰ的生物