常染色體顯性多囊腎病發(fā)病機(jī)制的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、常染色體顯性多囊腎病(autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳性腎臟疾病之一，發(fā)病率約1/400～1/1000，主要表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟形成多個(gè)液性囊腫、進(jìn)行性增大，破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭。除累及腎臟外，該病還引起肝囊腫、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、心臟瓣膜異常等系統(tǒng)損害。目前缺乏高靈敏度、高特異性、簡(jiǎn)便易行的早期診斷方法，并無有效的治療手段。近年來，隨該病研究

2、的深入，其發(fā)病機(jī)制的闡述正不斷更新，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。而今比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析為尋找與疾病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)提供了新途徑，使研究者得以由全面探索發(fā)病中發(fā)生變化的蛋白質(zhì)入手，從一個(gè)嶄新的視角認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制。該研究采用同位素編碼的親和標(biāo)簽技術(shù)(isotope-codedaffinitytag，ICAT)與二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(twodimensionalliquidchromatography-tandemmassspectrom

3、etry，2DLC-MS/MS)相結(jié)合的定量比較蛋白組學(xué)方法對(duì)ADPKD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，旨在盡可能多地尋找與該病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步闡明ADPKD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為該病的早期診斷標(biāo)志物及治療靶標(biāo)的開發(fā)研究提供新思路。 該文首先制備了ADPKD患者(多囊腎病基因1突變)與正常成人尿液、血清蛋白組樣品，以及囊腫襯里上皮細(xì)胞與正常腎小管上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)組樣品，分別對(duì)兩尿液、兩血清及兩細(xì)胞蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行比較。在兩參比

4、蛋白質(zhì)組中，用CleavableICAT重試劑(含9個(gè)13C)標(biāo)記ADPKD患者蛋白質(zhì)組樣品，用CleavableICAT輕試劑(含9個(gè)12C，較重試劑輕9Da)，標(biāo)記位點(diǎn)為肽鏈上的cysteine殘基。標(biāo)記后的兩參比蛋白質(zhì)組樣品混和并以胰蛋白酶水解，經(jīng)陽離子交換去除未反應(yīng)試劑等雜質(zhì)后，以avidin親和層析柱將溶液中含cysteine的被標(biāo)記肽段(含親和力標(biāo)簽biotin)篩選出來。篩選出的被標(biāo)記肽段混合物裂解去除親和力標(biāo)簽并以2DL

5、C-MS/MS進(jìn)行分離和質(zhì)量檢測(cè)，并通過ProICAT軟件分析，鑒定被標(biāo)記肽段，從而鑒定蛋白質(zhì)。同時(shí)，軟件計(jì)算某蛋白質(zhì)各重試劑標(biāo)記肽段的肽指紋總面積與各輕試劑標(biāo)記肽段的肽指紋總面積比(H：L)作為該蛋白質(zhì)在ADPKD樣品與正常對(duì)照樣品中的豐度比。從被鑒定的差異蛋白質(zhì)中，選擇肽段可信度最高的血清白蛋白(serumalbumin，SALB)，并在差異蛋白質(zhì)中隨機(jī)選擇5種尿蛋白質(zhì)、4種血清蛋白質(zhì)以及4種細(xì)胞蛋白質(zhì)，分別用免疫印跡法或免疫熒光結(jié)

6、合激光共聚焦掃描的方法驗(yàn)證其在兩對(duì)應(yīng)參比蛋白組樣品中的豐度差異。 經(jīng)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，兩尿蛋白質(zhì)組共鑒定出106種蛋白質(zhì)，ADPKD患者中水平較正常上調(diào)者48種，下調(diào)者45種；兩血清蛋白質(zhì)組樣品中共鑒定出159種蛋白質(zhì)，ADPKD患者中水平較正常上調(diào)者24種，下調(diào)者24種；兩細(xì)胞蛋白質(zhì)組樣品中共鑒定出蛋白質(zhì)130種，ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞中水平上調(diào)者35種，下調(diào)者61種。免疫學(xué)方法驗(yàn)證顯示：SALB在ADPKD患者尿蛋白質(zhì)

7、組樣品與正常成人尿蛋白質(zhì)組樣品中免疫印跡條帶灰度比(1.18)和ICAT-2DLC-MS/MS分析提供的H：L(0.6904)存在差異。因此，選擇豐度水平上調(diào)超過100％及下調(diào)超過50％的蛋白質(zhì)(包括肽指紋僅見重試劑或輕試劑標(biāo)記的單峰的蛋白質(zhì))作為差異蛋白，盡量避免2DLC-MS/MS以肽指紋峰面積比反映蛋白質(zhì)豐度比可能帶來的系統(tǒng)誤差。在接受豐度差異免疫學(xué)驗(yàn)證的差異蛋白質(zhì)中，除lamininα2在囊腫襯里上皮細(xì)胞與正常腎小管上皮細(xì)胞中未

8、表現(xiàn)明顯差異外，其余蛋白質(zhì)在ADPKD尿液、血清蛋白質(zhì)組樣品或囊腫襯里上皮細(xì)胞中均顯示與ICAT-2DLC-MS/MS分析結(jié)果方向一致的豐度變化。 根據(jù)研究結(jié)果提示的信息，可以看到包括多囊蛋白-1在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)成分在ADPKD患者尿液、血清及囊腫襯里上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組中發(fā)生豐度改變，這些差異蛋白包括生長(zhǎng)因子、凋亡調(diào)節(jié)蛋白、參與胞漿運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)成分、受體、細(xì)胞信號(hào)蛋白、酶類、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等，可能分別在囊腫襯里