Th17細(xì)胞與Graves病的相關(guān)研究.pdf

1、目的：Graves病(Graves disease，GD)是一種由于自身免疫導(dǎo)致的器官特異性自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)，臨床表現(xiàn)為不同程度的彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺毒癥、浸潤性突眼、脛前粘液性水腫，自身抗體產(chǎn)生、甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤是其重要病理特征。但詳細(xì)的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制尚不清楚。
　　Th17細(xì)胞是一種能產(chǎn)生白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)的

2、新型CD4+T淋巴細(xì)胞。IL-17的主要功能是作為一種前炎癥細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、IL-6等細(xì)胞因子，吸引中性粒白細(xì)胞和單核細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，促進(jìn)或擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。已有研究表明，Th17細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。GD

3、是典型的自身免疫性甲狀腺疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，本研究擬通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中CD4+IL-17+T(Th17)細(xì)胞的數(shù)量；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平；應(yīng)用實時定量(qRT-PCR)檢測PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA的表達(dá)量；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測甲狀腺組織中IL

4、-17+細(xì)胞的分布及數(shù)量變化，旨在探討Th17細(xì)胞在GD發(fā)生中的作用。
　　方法：
　　1研究對象及材料
　　收集30例初發(fā)未經(jīng)過任何治療的GD患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國甲狀腺疾病診治指南》(中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)會，2008年)。將30例年齡、性別相匹配的健康體檢者作為正常對照組。免疫組化標(biāo)本來自6例Graves病患者手術(shù)切除的甲狀腺和3例創(chuàng)傷死亡的正常甲狀腺組織。
　　2方法
　　2.1血清TSH、FT3、F

5、T4水平的檢測
　　用商用電化學(xué)發(fā)光法檢測初發(fā)GD患者和正常對照組的血清中促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游離甲狀腺素(freethyroxine，F(xiàn)T4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)的水平。
　　2.2 PBMC中Th17細(xì)胞數(shù)量檢測
　　采用密度梯度離心法分離新鮮PBMC，經(jīng)抗人CD3 mAb、抗人CD28mAb刺激培養(yǎng)

6、24小時后，取PBMC2×105個，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測初發(fā)GD患者和正常對照組PBMC中CD4+T細(xì)胞和CD4+IL-17+T(Th17)細(xì)胞的數(shù)量。
　　2.3 PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平檢測
　　采用密度梯度離心法分離新鮮PBMC，經(jīng)抗人CD3 mAb、抗人CD28mAb刺激培養(yǎng)24小時后，取上清，用人IL-17 ELISA試劑盒檢測初發(fā)GD患者和正常對照組PBMC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-17的水平。
　　2

7、.4 PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4mRNA表達(dá)水平
　　提取2.2所述剩余PBMC的mRNA，反轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA的相對表達(dá)量，以人GAPDH作為內(nèi)參照基因。
　　2.5甲狀腺組織中IL-17+細(xì)胞的分布和數(shù)量
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測甲狀腺組織中IL-17+細(xì)胞的分布和數(shù)量。
　　2.6統(tǒng)計學(xué)分析：
　　應(yīng)用SPSS13.

8、0統(tǒng)計軟件，計量資料以x-±s表示，兩組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進(jìn)行比較。兩組間采用雙變量相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1血清TSH、FT3、FT4水平
　　收集的30例初發(fā)GD組患者均有血清TSH濃度降低，甲狀腺激素FT3、FT4升高，符合GD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　2 PBMC中Th17細(xì)胞數(shù)量變化
　　經(jīng)抗人CD3 mAb、抗人CD28 mAb刺激培養(yǎng)24小時后

9、，與正常對照組比較，初發(fā)GD組外周血PBMC中CD4+IL-17+T(Th17)細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例(21.95±3.62％)較正常對照組(9.26±5.85％)明顯升高(P＜0.01)。
　　3 PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平
　　經(jīng)抗人CD3 mAb、抗人CD28 mAb刺激培養(yǎng)24小時后，初發(fā)GD組PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平(80.56±40.59 pg/ml)與正常對照組(15.05±7.82 pg/m

10、l)相比明顯升高(P＜0.01)。
　　4 PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA的表達(dá)水平
　　初發(fā)GD組PBMC經(jīng)抗人CD3 mAb、抗人CD28 mAb刺激培養(yǎng)24小時后，ROR-γt mRNA表達(dá)水平(1.67±0.93)與正常對照組(0.93±0.17)比較明顯增高(P＜0.05)。而IFN-γ、IL-4 mRNA的表達(dá)水平與正常對照組比較均明顯降低(0.31±0.08 vs0.69±0.20，2.

11、53±0.70 vs7.29±0.83，P＜0.01)。
　　5甲狀腺組織中IL-17+細(xì)胞的分布及數(shù)量
　　正常對照組甲狀腺組織未見IL-17+陽性細(xì)胞。GD組甲狀腺組織濾泡間質(zhì)內(nèi)可見散在的IL-17+陽性細(xì)胞。
　　6初發(fā)GD組患者PBMC中Th17細(xì)胞百分率與血清TSH濃度、血清FT3濃度、血清FT4濃度、ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析
　　初發(fā)GD組患者，PBMC中CD4+

12、IL-17+T(Th17)細(xì)胞百分率與血清TSH濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4205，P＜0.05)；與血清FT3濃度呈正相關(guān)(r=0.5930，P＜0.01)；與血清FT4濃度呈正相關(guān)(r=0.5580，P＜0.01)；與ROR-γt mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.5047，P＜0.05)；與IFN-γ mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5085，P＜0.01)；與IL-4 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)
　　(r=-0.5372，P＜0

13、.01)。
　　結(jié)論：
　　1 GD患者PBMC中Th17細(xì)胞的數(shù)量、PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平均明顯增高；Th17細(xì)胞百分率與血清TSH濃度呈負(fù)相關(guān)，與血清FT3濃度、血清FT4濃度呈正相關(guān)；甲狀腺組織濾泡間質(zhì)有散在IL-17+細(xì)胞。提示Th17細(xì)胞在GD的發(fā)病中發(fā)揮一定作用。
　　2 GD患者PBMC接受刺激后ROR-γt mRNA表達(dá)量明顯增高，IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表達(dá)水平明顯降低，提示患