LASER通過HNF-1α-PCSK9調(diào)控膽固醇代謝及zonulin易化腸道細(xì)菌移位致動(dòng)脈硬化的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 LASER通過HNF-1α-PCSK9途徑調(diào)控肝臟膽固醇代謝
　　背景：
　　高脂血癥是動(dòng)脈硬化性心血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素之一。血脂水平與許多因素有關(guān)，其中遺傳變異是研究熱點(diǎn)。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)許多基因的單核昔酸多態(tài)性與血脂水平相關(guān)，這些變異可以解釋約10-12％的變異幅度。然而約43％的變異位于基因間的非編碼區(qū)域，其功能尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)基因的非編碼區(qū)域可以轉(zhuǎn)

2、錄出眾多的非編碼RNA，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA更易于分布在疾病相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)區(qū)域。如9p21編碼ANRIL并與PRC2蛋白結(jié)合而調(diào)控下游基因的表達(dá)。因此，我們提出脂蛋白相關(guān)的關(guān)聯(lián)分析區(qū)域同樣可以編碼lncRNA并調(diào)控脂代謝。
　　目的：
　　研究肝臟中是否存在調(diào)控脂代謝的lncRNA。
　　方法：
　　以qRT-PCR的方法測(cè)定外周白細(xì)胞中LASER的表達(dá)。以RNA干擾的方法降低HepG2細(xì)胞內(nèi)LASER的表達(dá)后

3、，以酶法或Filipin染色測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，以基因芯片分析干擾LASER后有哪些基因發(fā)生了改變。RNA-蛋白質(zhì)間的相互作用通過RNA免疫共沉淀證實(shí)，HNF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白甲基化通過染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　我們?cè)谘嚓P(guān)多態(tài)性熱點(diǎn)區(qū)域鑒定了一個(gè)lncRNA(LASER)。臨床研究發(fā)現(xiàn)LASER的表達(dá)與含膽固醇的脂蛋白及PCSK9含量呈正相關(guān)。降低LASER的表達(dá)后可以降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平并影響

4、膽固醇代謝的相關(guān)基因，其中PCSK9及其轉(zhuǎn)錄因子HNF-1α的表達(dá)均下降。同時(shí)，在給予HNF-1α的天然的拮抗劑黃連素后可以阻斷LASER對(duì)PCSK9的作用。LASER通過在核內(nèi)與CoREST/REST蛋白復(fù)合體的LSD1結(jié)合干擾了LSD1的活性，從而導(dǎo)致HNF-1α基因啟動(dòng)子抑制性的H3K4me2增加。與此同時(shí)，降低LSD1的表達(dá)則可以阻斷LASER對(duì)HNF-1α-PCSK9的作用。最后，我們發(fā)現(xiàn)他汀類可以升高LASER的表達(dá)，同時(shí)導(dǎo)

5、致PCSK9增加，膽固醇可以反向激活LXR受體調(diào)控LASER的表達(dá)。我們的研究可能部分解釋了“他汀逃逸”的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的調(diào)控肝臟膽固醇代謝的lncRNA-LASER。而抑制LASER可與他汀協(xié)同發(fā)揮聯(lián)合調(diào)脂的效應(yīng)。
　　第二部分 Zonulin易化腸道細(xì)菌移位參與動(dòng)脈硬化的機(jī)制研究
　　背景：
　　動(dòng)脈硬化性心血管疾病導(dǎo)致的死亡仍高居不下，其中炎癥激活在動(dòng)脈硬化的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的

6、作用。大量的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冠心病的發(fā)生與多種病原微生物相關(guān)（肺炎衣原體、幽門螺桿菌及巨細(xì)胞病毒等）。腸道中存在著種類眾多的共生菌。腸道共生菌可以通過磷脂酰膽堿和左卡尼汀的代謝而間接致動(dòng)脈硬化，但目前仍缺乏腸道微生物直接致動(dòng)脈硬化的直接證據(jù)。約95％的動(dòng)脈硬化斑塊中能檢測(cè)到細(xì)菌的16SrRNA基因成分，其中以腸桿菌科為主。同時(shí)，我們前期發(fā)現(xiàn)冠心病人全血中腸道菌屬的熒光假單胞菌及沙雷氏菌含量增加，提示除了間接作用外，腸道細(xì)菌還可能直接參與

7、了動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。
　　生理狀況下腸道間的緊密連接將腸道細(xì)菌與循環(huán)隔絕開來，在動(dòng)脈硬化等病理情況下細(xì)菌能否穿過腸道屏障并進(jìn)入動(dòng)脈硬化斑塊內(nèi)目前尚不清楚。腸道細(xì)胞間的緊密連接在決定腸道通透性及控制腸道細(xì)菌移位方面發(fā)揮了重要的作用，其中zonulin（連蛋白）是腸道細(xì)胞合成的分泌蛋白，在調(diào)節(jié)緊密連接開放和決定腸道細(xì)胞通透性方面發(fā)揮了重要的作用。既往研究表明循環(huán)中zonulin的水平在糖尿病、肥胖等動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因素中升高。
　　

8、目的：
　　動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展中，是否也有zonulin的改變，而zonulin調(diào)控的腸道通透性改變是否參與了腸道細(xì)菌的移位呢？
　　方法：
　　以ELISA的方法測(cè)定血漿中的zonulin含量。體外培養(yǎng)Caco2細(xì)胞層構(gòu)建腸上皮屏障模型，培養(yǎng)熒光假單胞菌并以菌液干預(yù)腸上皮屏障模型。于不同時(shí)間點(diǎn)取Transwell小室的上層及下層的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，并照相記錄菌落生長(zhǎng)情況。以掃描電鏡觀察熒光假單胞菌暴露對(duì)腸上皮屏障