PCSK9 siRNA經(jīng)線粒體途徑抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡.pdf

1、研究背景：
　　內(nèi)膜損傷是動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis, As）的始發(fā)環(huán)節(jié)。研究表明oxLDL引起平滑肌細(xì)胞凋亡，可能與上調(diào) P53和下調(diào) Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。另一些研究已證實(shí)oxLDL與細(xì)胞膜表面的受體 LOX-1結(jié)合引起內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，主要經(jīng)下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，線粒體依賴性凋亡信號(hào)通路。
　　PCSK9作為一種神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶，參與肝臟的再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，脂質(zhì)代謝等多種作用。通過降低

2、肝細(xì)胞上LDLR的數(shù)量，影響LDL的內(nèi)化，使血液中LDL不能清除，從而導(dǎo)致高膽固醇血癥。高膽固醇血癥是一個(gè)已被確認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另有研究證實(shí)PCSK9在胚胎發(fā)育中具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的作用，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，在此過程中有凋亡調(diào)節(jié)因子Caspase3和死亡受體6的共同調(diào)節(jié)。本課題組的前期研究表明：PCSK9 siRNA能明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞的凋亡，但其機(jī)制不清。PCSK9 s

3、iRNA是否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡也有影響還未見報(bào)道。
　　目的：
　　本研究為了檢測oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡中PCSK9的表達(dá)變化；PCSK9 siRNA是否抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及探討其機(jī)制。
　　材料與方法：
　　用不同濃度的oxLDL處理HUVECs24h，Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡，RT-PCR、western blot分別檢測PCSK9 mRNA、LOX-1 mRNA

4、和NARC-1、LOX-1蛋白的表達(dá)。應(yīng)用 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染不同濃度的PCSK9 siRNA進(jìn)入HUVECs，篩選出最有效的siRNA濃度轉(zhuǎn)染HUVECs24 h后，再加入oxLDL處理24 h，Hoechst33258染色觀察評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡，western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax及Caspase3，-8，-9的表達(dá)，酶標(biāo)法檢測Caspase3和Caspase9的活性，Hoechst33258染色

5、觀察形態(tài)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)凋亡率。
　　結(jié)果：
　　隨著oxLDL濃度的不斷增加，HUVECs凋亡率逐漸增加，以80μg/ml oxLDL處理24h后，Hoechst33258染色可見大量凋亡細(xì)胞。同時(shí)RT-PCR、western blot檢測發(fā)現(xiàn)LOX-1和NARC-1mRNA，蛋白表達(dá)均增高。不同濃度的PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs后，RT-PCR和western blot篩選出siRNA終濃度，作用細(xì)胞

6、24 h后，再用oxLDL處理24 h，Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測oxLDL處理組細(xì)胞凋亡率明顯增加，轉(zhuǎn)染PCSK9 siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯減少。而RT-PCR和western blot檢測結(jié)果表明LOX-1的蛋白和mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)染PCSK9 siRNA組和oxLDL組無明顯差異。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCSK9 siRNA能明顯下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)觀察轉(zhuǎn)染80nmo

7、l/L PCSK9 siRNA后用oxLDL處理細(xì)胞24小時(shí)其對(duì)Caspase3，Caspase8和Caspase9的影響，western blot結(jié)果顯示Caspase3，Caspase9的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而對(duì)Caspase8的蛋白表達(dá)無影響。酶標(biāo)法檢測Caspase3，Caspase9的活性均降低。
　　結(jié)論：
　　1.OxLDL能上調(diào)PCSK9 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而PCSK9 siRNA能有效抑制PCSK9基因