海參養(yǎng)殖池耐藥菌的分析及五株海洋新菌的鑒定.pdf

1、海參養(yǎng)殖是海洋經(jīng)濟(jì)中的一大產(chǎn)業(yè)，海參養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥菌的分布是人們比較關(guān)心的問(wèn)題。抗生素進(jìn)入海水養(yǎng)殖環(huán)境篩選出耐藥細(xì)菌，增加環(huán)境中耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移和重組，造成耐藥基因在環(huán)境、動(dòng)物和人體細(xì)菌抗性染色體中的流通，從而導(dǎo)致耐藥基因轉(zhuǎn)移至人體致病菌的抗性染色體中，危害人類健康。因此耐藥菌的分布分析有著非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以在榮成兩處海參養(yǎng)殖池(122°14′34″E36°54′36″N)和雙島灣(121°57′52″E37°28′16″N)中

2、采集的五組樣品(SS1、WS1、SS2、WS2、WS3)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用稀釋涂布法估算SS1、WS1、SS2、WS2、WS3每克或者每毫升樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量，分別約為54.4×104、3.6×104、40×104、20.5×104、4.2×104，通過(guò)不同的抗生素篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，所有樣品中，四環(huán)素和克林霉素耐性菌的比例都相對(duì)較高。藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株的表型耐藥性，計(jì)算MAR指數(shù)，比較分析五組樣品間耐藥菌分布的異同。我們發(fā)現(xiàn)

3、沉積物樣品中耐藥菌的分布顯著大于水樣品中耐藥菌的分布;分離菌株對(duì)氨基糖苷類、四環(huán)素類、林可酰胺類抗生素的耐藥頻率顯著高于分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、利福平、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類抗生素的耐藥頻率;耐藥菌在海參養(yǎng)殖環(huán)境和遠(yuǎn)離人類活動(dòng)的非養(yǎng)殖環(huán)境中都有分布;在分離到的多重耐藥菌中，變形菌門細(xì)菌占43.28％，厚壁菌門細(xì)菌占28.36％，擬桿菌門細(xì)菌占25.37％，放線菌門細(xì)菌占2.99％?；?6S rDNA序列，分析了105株分離菌株

4、的分類地位并將其保藏入-80℃超低溫冰箱，其中變型菌門細(xì)菌53株，厚壁菌門細(xì)菌26株，擬桿菌門細(xì)菌24株，放線菌門細(xì)菌2株，其中相似度小于98％的潛在新細(xì)菌32株。
　　除了分析海參養(yǎng)殖環(huán)境耐藥菌的分布之外，本實(shí)驗(yàn)還從不同的樣品中分離到五株海洋新細(xì)菌，利用多相分類的手段鑒定其分類地位。
　　從北極某海域(8°21′629″E72°8′827″N)沉積物中分離到一株海洋新細(xì)菌，編號(hào)為435。過(guò)氧化氫酶和氧化酶都是陽(yáng)性，菌落呈現(xiàn)

5、似大米透明色，兼性厭氧，革蘭氏陰性。菌株435T的細(xì)胞形態(tài)為短桿或彎曲桿狀，耐受溫度范圍是4-25℃、pH6.0-9.0、耐受鹽度范圍是0.5-6.0％(w/v) NaCl。呼吸醌為Q-8，主要極性脂是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油，主要脂肪酸是C15∶1ω8c、sum in feature3(comprising C16∶1ω7c/15 iso2-OH)、 C17∶1ω8c、C15∶0。16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株435T與科

6、爾韋爾氏菌屬相似度在92.1％-95.6％之間，基因組DNAG+C含量是38.7 mol％。綜合不同的表型特征以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和遺傳學(xué)分析，建議菌株435T(=CICC10860T=ATCC BAA-2609T)代表科爾韋爾氏菌屬的一個(gè)新物種，命名為北極科爾韋爾氏菌（Colwelliaarctica sp.nov.）。
　　菌株SY21T是分離自威海近海海岸帶(122°0′37″E37°31′33″N)沉積物的一株海洋新細(xì)菌。最適生

7、長(zhǎng)溫度在33-37℃之間，最適生長(zhǎng)pH為pH7.0-7.5，最適鹽度2-3％(w/v) NaCl。呼吸醌類型是MK-7，主要脂肪酸包括iso-C15∶0、iso-C17∶03-OH和anteiso-C15∶0，主要極性脂是磷脂酰乙醇胺、氨脂質(zhì)和一個(gè)未知成分的脂質(zhì)，基因組DNA G+C含量是37.9 mol％。根據(jù)16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株SY21T與厭氧海洋吞噬菌JCM18693T的相似度最高(94.7％)。依據(jù)與其他菌

8、株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和不同的表型特征，菌株SY21T可以和其他菌株區(qū)分開(kāi)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以說(shuō)明菌株SY21T是海洋吞噬菌屬的一個(gè)新物種，建議命名為沉積物海洋吞噬菌（Mariniphaga sediminis sp.nov.），模式菌株是SY21T(=KCTC42260T=MCCC1H00107T)。
　　菌株FB218T是通過(guò)富集分離的方法得到的來(lái)自于山東威海榮成某海參養(yǎng)殖池的底泥(122°14′25.9″E36°57′26.2″N)的細(xì)菌

9、。菌落呈黃色，革蘭氏陰性、兼性厭氧。16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株FB218T應(yīng)該歸屬于海洋滑動(dòng)菌科，和嗜中溫羧酸利用桿菌JCM18290T和大安縣羧酸利用桿菌JCM19490T親緣關(guān)系最相近。菌株FB218T的主要脂肪酸包括iso-C15∶0、iso-C17∶03-OH、iso-C15∶03-OH和anteiso-C15∶0，主要極性脂是兩個(gè)未知成分的脂質(zhì)和磷脂，呼吸醌是MK-7?；蚪MDNA G+C含量是40.0 mo

10、l％。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明菌株FB218T代表了羧酸利用桿菌屬的一株新物種，建議命名為細(xì)線形羧酸利用桿菌。模式菌株是FB218T（Carboxylicivirga linearis sp.nov.），模式菌株為FB218T(=KCTC42260T=MCCC1H00107T)。
　　菌株MF326T來(lái)源于威海榮成某海參池沉積物(122°14′34″E36°54′36″N)，菌落為黃色，革蘭氏陰性、兼性厭氧。基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育

11、分析，菌株MF326T與牡蠣海研站菌和藻海研站菌相似度最高，分別是94.3％和93.9％，可以說(shuō)明菌株MF326T應(yīng)該是海研站菌屬的一株新物種。菌株MF326T的主要脂肪酸是iso-C15∶0，、鏈長(zhǎng)為13.565的未知脂肪酸和anteiso-C15∶0，主要極性脂是兩個(gè)未知成分的脂質(zhì)和磷脂酰乙醇胺。呼吸醌類型是MK-6，基因組DNA G+C含量是40.7mol％。綜合分析，菌株MF326T是海研站菌屬的一株新細(xì)菌，建議命名沉積物海研站

12、菌（Mesonia sediminis sp.nov.），模式菌株MF326T(=KCTC42255T=MCCC1H00125T)。
　　菌株HQYD1T分離于柄海鞘，是一株革蘭氏陰性、兼性厭氧、菌落呈橙色的海洋細(xì)菌。菌株HQYD1T的細(xì)胞桿狀且能通過(guò)滑動(dòng)的方式運(yùn)動(dòng)。最適生長(zhǎng)溫度是28℃，最適生長(zhǎng)鹽度是2-3％NaCl。菌株HQYD1T的16S rRNA基因序列與菌株Y11T的相似度最高(94.83％)，其次是與發(fā)酵糖絲菌DSM9

13、555T(92.28％)。菌株HQYD1T檢測(cè)到的主要脂肪酸是C16∶0、C18∶0和iso-C15∶0，主要極性脂是兩個(gè)未知成分的脂質(zhì)和磷脂，主要呼吸醌類型是MK-7。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議建立滑動(dòng)桿菌屬為海洋滑動(dòng)菌科的一個(gè)新屬，建議菌株HQYD1T為滑動(dòng)桿菌屬的一個(gè)新物種，新屬命名為滑動(dòng)桿菌屬（Labilibacter gen.nov.），新種命名為橙色滑動(dòng)桿菌(Labilibacter aurantiaca gen.nov.sp.no

14、v.)，模式菌株HQYD1T(=MCCC1K02304T=KCTC42583T)。另外，建議將原海洋糖絲菌Y11T修訂，劃分到滑動(dòng)桿菌屬，命名為海洋滑動(dòng)桿菌（Labilibacter marina comb.nov.），模式菌株是Y11T(=CICC10837T=KCTC42400T)。
　　本實(shí)驗(yàn)分析了海參養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥細(xì)菌的分布，可以為有關(guān)部門的監(jiān)管和治理提供理論基礎(chǔ);鑒定了五株海洋新細(xì)菌，豐富了海洋微生物資源庫(kù)，同時(shí)也為一些