低溫誘導高效異源表達載體pSW4的構(gòu)建和應用研究.pdf

1、海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，蘊含著豐富的生物基因資源，深海是海洋的主要組成部分，普遍具有黑暗、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等環(huán)境特征。由于絕大多數(shù)環(huán)境微生物無法在實驗室中被培養(yǎng)，基因異源表達是獲取深海生物基因資源的理想途徑之一。目前常用的異源基因表達系統(tǒng)在使用過程出現(xiàn)的基因不表達、蛋白失活及形成包涵體等問題在一定程度上限制了深海生物基因資源的開發(fā)利用。因此，構(gòu)建或改造高效的深海基因表達體系對于深海來源活性蛋白的研究及利用具有很大的意義。
　

2、　本實驗室前期已經(jīng)在深海細菌Shewanella piezotoleransWP3天然噬菌體SW1的基礎上構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pSW2。雖然其可用于缺失基因的回補和蛋白低溫表達，但pSW2作為表達載體仍存在一些問題，例如載體序列冗余、復制起點未知、表達效率較低、沒有純化標簽等。本研究通過對pSW2的最小化敲除、啟動子替換及純化標簽添加等改造，成功構(gòu)建了高效低溫誘導表達載體pSW4。以GFP為報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，pSW4的表達效率較pSW2有顯著

3、提升（20℃提高5～6倍，4℃提高10倍以上），利用該載體成功表達了深海細菌S.psychrophilaWP2的聚合酶亞基。WP3-pSW4體系適用于原位表達深海來源的蛋白，包涵體蛋白以及溫度敏感型蛋白(thermolabile proteins)。
　　此外，我們還對SW1的復制機制進行了探討。通過載體突變及接合轉(zhuǎn)移實驗確定并證實了絲狀噬菌體SW1上的復制起點是位于fpsR下游非編碼序列的一段91bp片段中，分析發(fā)現(xiàn)其存在典型回