3α-HSD-CR和aiiA雙基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)具有降解許多難降解化合物的能力，在污染物的生物修復(fù)上具有很高的應(yīng)用價值。C.Testosteroni 具有降解甾核的關(guān)鍵酶3a-羥類固醇脫氫酶/碳酰基還原酶(3a-hydroxysteroid dehydrogenase/ carbonyl reductase，3a-HSD/CR)基因，能夠以睪丸酮、孕酮和膽汁酸等類固醇類物質(zhì)為唯一碳源和能源，該菌在這些危害大的穩(wěn)定化合物的

2、生物修復(fù)中起重要作用。然而，涉及這些物質(zhì)降解的酶在該菌中是誘導(dǎo)表達(dá)的。因此，該菌對污染物的消化降解速度很慢，限制了該菌在生物修復(fù)中的大規(guī)模應(yīng)用。蘇云金芽孢桿菌(Baci llus thuringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽性產(chǎn)孢細(xì)菌，能形成殺蟲蛋白、外毒素、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等多種毒素，對多種昆蟲以及線蟲、螨蟲、原生動物都有活性。Bt aiiA基因所編碼的AiiA蛋白是一種可以降解N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoseri

3、ne lactones，AHLs)的內(nèi)酯酶，從而減弱某些致病菌產(chǎn)生的危害。
　　 本研究將3a-HSD/CR和aiiA這兩個基因相連接構(gòu)建了雙基因融合表達(dá)載體，純化并檢測了融合蛋白的生物活性。同時也構(gòu)建了真核表達(dá)載體。研究方法和結(jié)果如下：
　　 根據(jù)GenBank上已公布的3α-HSD/CR(774 bp)全長基因序列，設(shè)計一對PCR擴(kuò)增引物。構(gòu)建了3α-HSD/CR基因表達(dá)載體pET29a-3α-HSD/CR，在大腸桿

4、菌BL21 里進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 根據(jù)GenBank上已公布的aiiA(753 bp)全長基因序列，設(shè)計一對PCR擴(kuò)增引物。以質(zhì)粒pET29a-3α-HSD/CR為載體構(gòu)建了3α-HSD/CR與aiiA基因完全融合的重組質(zhì)粒pET29a-3α-HSD/CR-aiiA，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3α-HSD/CR-aiiA融合蛋白，用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。利用Qiagen公司的N

5、i-NTA Spin Column進(jìn)行3α-HSD/CR-aiiA融合蛋白的分離純化。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)分別分析了3α-HSD/CR-aiiA融合蛋白表達(dá)及其對睪丸酮降解能力。檢測融合蛋白對馬鈴薯軟腐病抑制作用。
　　 結(jié)果表明：
　　 擴(kuò)增出了3α-HSD/CR(774 bp)及aiiA(753 bp)基因，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET29a-3α-HSD/CR-aiiA，SDS

6、-PAGE分析顯示重組質(zhì)pET29a-3α-HSD/CR-aiiA在原核系統(tǒng)中得到了表達(dá)。成功構(gòu)建了pET29a-3α-HSD/CR-aiiA雙基因的原核融合表達(dá)載體。通過HPLC試驗表明融合蛋白對睪丸酮有很好的降解能力。通過抑菌實(shí)驗證實(shí)融合蛋白對胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora)引起的馬鈴薯軟腐病有較好的抑制作用。
　　 以pET29a-3α-HSD/CR-aiiA質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得3α-HS