花生特異表達(dá)抗病基因的載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生易受黃曲霉菌的侵染而產(chǎn)生黃曲霉毒素,嚴(yán)重影響了花生的食品安全?；ㄉv殼和種衣是對(duì)抗黃曲霉侵染的重要屏障；花生生長后期是黃曲霉侵染花生的關(guān)鍵時(shí)期。改變花生果、種皮的組成結(jié)構(gòu)特征可望培育出抗性品種。長期以來,國內(nèi)外通過常規(guī)育種培育的抗黃曲霉品種皆表現(xiàn)抗性不穩(wěn)定,且進(jìn)展緩慢。鑒此本實(shí)驗(yàn)室在國際上最早開展了通過基因工程手段以培育抗性品種。為了提高轉(zhuǎn)基因的安全性,先后開展了花生果、種皮特異性表達(dá)啟動(dòng)子克隆和無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。本文研究利用已

2、克隆的特異啟動(dòng)子構(gòu)建果皮特異表達(dá)載體,用已開發(fā)的抗生素誘導(dǎo)刪除工具載體構(gòu)建雙價(jià)載體,并對(duì)以前構(gòu)建的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)遺傳化研究,結(jié)果如下。
　　 1.利用實(shí)驗(yàn)室已有的花生果種皮特異啟動(dòng)子(8＃、13＃)和CHI基因、GLU基因、COMT基因、RS基因,構(gòu)建了6個(gè)可改變花生果種皮化學(xué)組成或增強(qiáng)抗性的植物表達(dá)載體。
　　 2.利用實(shí)驗(yàn)室已有的果種皮特異啟動(dòng)子(8＃、13＃和S19＃)驅(qū)動(dòng)CHI基因、GLU基因、CBF2基因、RS基因

3、的單價(jià)載體和基于Cre-loxP的抗生素誘導(dǎo)刪除工具載體,構(gòu)建了2個(gè)植物表達(dá)雙價(jià)載體,分別命名為:pLoxp-8-CBF2-S19-RS,pLoxp-8-CHI-13-GLU。
　　 3.優(yōu)化了以胚軸為外植體的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MMS+30 mg／L BA+0.5 mg／L2.4-D時(shí),芽誘導(dǎo)率最高,當(dāng)伸長培養(yǎng)基為MMS+3mg／LBA+1 mg／L NAA+2 g／L碳粉伸長率最高；采用逐次篩選,前兩周的潮

4、霉素濃度10 mg／L,后兩周的潮霉素濃度為20 mg／L潮霉素時(shí),篩選效果最好；生根培養(yǎng)基的潮霉素濃度為1 mg／L時(shí)篩選效果最好,培養(yǎng)14～28天,當(dāng)根伸長至3～4cm時(shí),進(jìn)行嫁接。
　　 4.通過優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化以上構(gòu)建的載體及實(shí)驗(yàn)室以前保存的載體。得到了轉(zhuǎn)CHI和GLU基因的T0代植株。
　　 以上研究所構(gòu)建的花生果皮特異表達(dá)載體和抗生素誘導(dǎo)刪除的雙價(jià)載體,以及優(yōu)化的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,將為基因工程手段安全解決花