花生特異表達(dá)抗病基因的載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生易受黃曲霉菌的侵染而產(chǎn)生黃曲霉毒素,嚴(yán)重影響了花生的食品安全?；ㄉv殼和種衣是對抗黃曲霉侵染的重要屏障；花生生長后期是黃曲霉侵染花生的關(guān)鍵時期。改變花生果、種皮的組成結(jié)構(gòu)特征可望培育出抗性品種。長期以來,國內(nèi)外通過常規(guī)育種培育的抗黃曲霉品種皆表現(xiàn)抗性不穩(wěn)定,且進(jìn)展緩慢。鑒此本實驗室在國際上最早開展了通過基因工程手段以培育抗性品種。為了提高轉(zhuǎn)基因的安全性,先后開展了花生果、種皮特異性表達(dá)啟動子克隆和無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。本文研究利用已

2、克隆的特異啟動子構(gòu)建果皮特異表達(dá)載體,用已開發(fā)的抗生素誘導(dǎo)刪除工具載體構(gòu)建雙價載體,并對以前構(gòu)建的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)遺傳化研究,結(jié)果如下。
　　 1.利用實驗室已有的花生果種皮特異啟動子(8＃、13＃)和CHI基因、GLU基因、COMT基因、RS基因,構(gòu)建了6個可改變花生果種皮化學(xué)組成或增強(qiáng)抗性的植物表達(dá)載體。
　　 2.利用實驗室已有的果種皮特異啟動子(8＃、13＃和S19＃)驅(qū)動CHI基因、GLU基因、CBF2基因、RS基因

3、的單價載體和基于Cre-loxP的抗生素誘導(dǎo)刪除工具載體,構(gòu)建了2個植物表達(dá)雙價載體,分別命名為:pLoxp-8-CBF2-S19-RS,pLoxp-8-CHI-13-GLU。
　　 3.優(yōu)化了以胚軸為外植體的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MMS+30 mg／L BA+0.5 mg／L2.4-D時,芽誘導(dǎo)率最高,當(dāng)伸長培養(yǎng)基為MMS+3mg／LBA+1 mg／L NAA+2 g／L碳粉伸長率最高；采用逐次篩選,前兩周的潮

4、霉素濃度10 mg／L,后兩周的潮霉素濃度為20 mg／L潮霉素時,篩選效果最好；生根培養(yǎng)基的潮霉素濃度為1 mg／L時篩選效果最好,培養(yǎng)14～28天,當(dāng)根伸長至3～4cm時,進(jìn)行嫁接。
　　 4.通過優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化以上構(gòu)建的載體及實驗室以前保存的載體。得到了轉(zhuǎn)CHI和GLU基因的T0代植株。
　　 以上研究所構(gòu)建的花生果皮特異表達(dá)載體和抗生素誘導(dǎo)刪除的雙價載體,以及優(yōu)化的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,將為基因工程手段安全解決花